膽甾醇辛酸酯-辛酰基-1-13C的合成

盧偉京，李 帥，徐仲杰，盧 浩

(上海化工研究院，上海 200062)

膽甾醇辛酸酯-辛酰基-1-13C(簡記為膽甾醇辛酸酯-13C，ChO-13C)是一種13C呼吸試劑，用于診斷脂肪吸收和評價胰腺分泌不足，被認為是有效的診斷試劑，敏感性為68.2%，特異性為75%。[1-4]。

膽甾醇辛酸酯-13C的合成方法未見文獻報道，天然豐度膽甾醇酯合成一般常用酸酐法、酶催化法、酰氯法和縮合法。酸酐法是酸酐和膽固醇反應生成膽甾醇酯，具有路線短、條件溫和、收率高等優點[5-6]；酶法以假絲酵母脂肪酶合成膽甾醇油酸酯和使用假單胞菌脂肪酶合成膽甾醇22碳六烯酯[7-8]；酰氯法通常是將有機酸轉變為酰氯，酰氯再與膽固醇反應得到相應的膽甾醇酯[9-10]，產率為70%～93%[11-12]；縮合法是用縮合試劑促進羧酸和醇的反應[13-14]。

酶法的合成效果較好，但酶價格昂貴；酸酐法需要自制辛酸酐-13C，其合成較為繁瑣，收率偏低；酰氯法的產率高，但酰氯過量較多；縮合法具有反應條件溫和、合成路線短等優點。綜上所述，縮合法較為適宜。縮合法的反應機理是羧酸被縮合試劑活化，活化的羧酸再與膽固醇反應生成酯。為提高反應產率，加酯化催化劑可以進一步活化羧基，促進反應進行。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

高效液相色譜儀(HPLC)：儀器為日本島津公司產品，配LC-20AT進樣器；蒸發光檢測器(ELSD)：上海通微公司產品；色譜柱(Shim-Pack, HRC-SIL 4.6 mm×25 cm)：日本島津公司產品；TSQ Quantum Access液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS)：美國Thermo Electron公司產品，配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur3.1數據處理系統；HP 1100高效液相色譜系統：美國惠普公司產品，配有可變波長紫外檢測器和N2000色譜工作站(浙江大學)；WZZ-2B型自動旋光儀：上海精密科學儀器有限公司產品；Vance DSX-500核磁共振波譜儀(1H NMR)：德國Bruker公司產品。

1.2 主要試劑

膽固醇(Ch-OH)：分析純，上海晶純試劑有限公司產品；辛酸-1-13C：自制，13C同位素豐度為98.6 %13C，化學純度為98.0%[18]；N,N’-二環己基碳二亞胺(DCC)、叔胺、N,N’-二異丙基碳二酰亞胺(DIC)：分析純，上海共價化學科技有限公司；辛酸、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司產品；石油醚：分析純，江蘇強盛化工有限公司產品；膽甾醇辛酸酯13C標準樣品：

2 實驗方法

2.1 膽甾醇辛酸酯-13C的合成

縮合劑法合成膽甾醇酯-辛酰基-1-13C(ChO-13C)的反應式示于圖1，在縮合劑的作用下，膽固醇(Ch-OH)與辛酸-1-13C反應，生成ChO-13C。

在兩口燒瓶中加入膽固醇、辛酸、縮合劑，通氮氣保護，攪拌一段時間，反應過程中采用TLC監測，產物使用硅膠柱分離提純，TLC檢測收集洗脫液，旋轉蒸發洗脫液，得到白色固體產品。

圖1 縮合催化法合成膽甾醇酯-辛酰基-1-13CFig.1 Synthesis of cholesteryl octanoate-octanoyl-1-13C by a method of coupling-catalysis

2.2 膽甾醇辛酸酯-13C的表征

對合成的膽甾醇辛酸酯-13C產品進行HPLC-ELSD分析，分析條件為：流動相為V(正己烷)∶V(異丙醇)=99∶1，流速0.8 mL，柱壓3.5 MPa；ELSD檢測器，蒸發溫度60 ℃，載氣為空氣，載氣速度2.5 L/min。

采用LC-MS對合成的膽甾醇辛酸酯-13C進行結構和13C豐度測試，分析條件為：電噴霧電離方式(Electrospray Ionization, ESI)，噴霧電壓5 000 V，鞘氣296 475 Pa，輔助氣0 Pa，離子傳輸毛細管溫度330 ℃，正離子Q1模式全掃描，質量掃描范圍是m/z=35～800。

使用旋光儀對合成產品進行光學純度測試，分析條件：三氯甲烷溶劑，C=2.0，24 ℃，樣品的光學純度P由下式計算

P=[α]樣品24/[α]標樣24×100%

其中 [α]樣品24和[α]標樣24分別表示在24 ℃時樣品和標樣的比旋光度

采用1H NMR對合成的ChO-13C進行結構分析，檢測條件：500 Hz，CDCl3溶劑。

3 結果與討論

3.1 DCC為縮合劑的合成實驗

3.1.1辛酸用量對反應的影響

辛酸用量對反應的影響列于表1。以DCC為縮合劑，叔胺為酯化催化劑，產物經HPLC和LC-MS分析為目標化合物，表明該方法可行。1#產品純度低，過硅膠柱分離時收集到未反應的膽固醇，產品的純度和產率都較低，2#和3#的產品純度均為99.9%，但2#的辛酸利用率較3#高。因此，選擇辛酸過程10%的條件。

3.1.2DCC用量對反應的影響

DCC用量對ChO合成的影響結果列于表2。提高DCC用量，以促進反應進行，2#反應產物中有過量的膽固醇，提高DCC用量為1.5倍和2.5倍，產率基本無變化。

表1 辛酸用量對反應的影響

注：反應條件為辛酸∶DCC∶叔胺=1∶1∶1(物質的量比)；每克膽固醇的二氯甲烷溶劑為31 mL；室溫，TLC確定合成時間約為24 h

表2 DCC用量對合成ChO影響

注：反應條件為辛酸∶膽固醇∶叔胺=1.1∶1∶1.1(物質的量比)；其余同表1

3.2 DIC為縮合劑的合成實驗

3.2.1DIC用量的影響

DIC用量對合成的影響列于表3。DIC代替DCC進行合成，其用量增加，產率有所提高，DIC與辛酸物質的量比值從1.0增加為1.5，產率從81.8%提高至84.3%，較DCC縮合劑的產率略有提高，比值增加至2.5時，產率提高為85.3%，但反應時為渾濁液，不利于合成。綜上所述，選擇縮合劑DIC與辛酸的物質的量比值為1.5較為適宜。

3.2.2溫度對反應的影響

溫度對反應的影響列于表4。ChO的合成反應通常在室溫進行，溫變化對反應的影響差別較小，屬于實驗誤差范圍(相對誤差小于1.4%)。可見，溫度對反應影響不大，一般為室溫。

表3 DIC用量對合成的影響

注：反應條件為縮合劑DIC，其余條件同表2

表4 溫度對反應的影響

注：反應條件為DIC∶辛酸∶膽固醇=1.5∶1∶1.65(物質的量比)，其余條件同表3

3.2.3正交設計優化

考察的試驗因素和水平表列于表5。采用正交設計進一步優化，實驗結果列于表6。

表5 試驗的因素和水平表

方差分析表列于表7。正交設計方差分析表明，因素1反應的影響顯著，因素2和因素3的影響不顯著。優化實驗條件為，因素1為1.5，因素2為24 ，因素3為31 。

對正交實驗結果進行3次實驗驗證，平均產率為84.1%，相對誤差小于1.1，純度99.5%～100%。

3.3 豐度合成實驗

以自制13C-辛酸為原料，按以上優化的條件，合成ChO-13C，產率84.1%，13C豐度為99.0%。

表6 ChO-13C合成試驗設計方案及結果L9(34)

表7 方差分析表

3.4 結構分析

3.4.1HPLC分析

ChO-13C的HPLC-ELSD分析結果示于圖2，產品的保留時間與標樣基本一致，分別為42.98 min和43.32 min，可以確定產品為目的產物，由面積比計算，化學純度為99.5%。

圖2 ChO-13C的HPLC-ELSD分析Fig.2 HPLC-ELSD spectrum of ChO-13C

3.4.2LC-MS分析

ChO-13C產品的LC-MS的分析示于圖3，m/z=536.49為[M+Na]峰(536.49≈513.84+23)，369.35為膽固醇脫羥基的碎片，161.14也是碎片峰；天然豐度產品的準分子離子峰為535.49，536.49表示產品上了一個13C。可以確定樣品是的膽甾醇辛酸酯-13C。由收集的536.49峰和535.50峰數據計算，產品的13C豐度為99.0 %。

圖3 ChO-13C的質譜圖Fig.3 ESI-MS spectrum of ChO-13C

3.4.3光學純度測試

由合成產品和標樣的旋光度測試，光學純度為99.0%。

3.4.4核磁共振分析

在膽甾醇辛酸酯上的氫原子的信號盡管較復雜，1H NMR 圖譜上的數據基本與SDBS數據庫[16]給出部分氫原子的歸屬一致。積分為61個氫，結構上是60個氫，在0.6～2.3區間積分有一定的誤差(相對誤差為1.67%)二者基本一致。可見，合成產品的1H NMR與膽甾醇辛酸酯的結構吻合，進一步確定是目標產物。

4 結 論

采用縮合法與催化法的組合方式，合成膽甾醇辛酸酯-辛酰基-1-13C，單因素優化與正交試驗優化合成條件，在DIC：叔胺：辛酸：膽固醇=1.65∶1.65∶1.1∶1(物質的量比)，每克膽固醇的二氯甲烷溶劑量31 mL，溫度24 ℃，反應時間24 h時，產率為84.1%，13C豐度為99.0%，光學純度為99.0%，化學純度為99.5%。經HPLC-ELSD、LC-MS和1H NMR表征，所合成的產品為膽甾醇辛酸酯-辛酰基-1-13C。

參考文獻：

[1] Ventrucci M, Cipolla A, Ubalducc GM, at al.13C labelled cholesteryl octanoate breath test for assessing pancreatic exocrine insufficiency[J]. Gut, 1998, 42: 81-87.

[2] McClean P, Harding M, Coward WA，et al.Bile Salt-Stimulated Lipase and Digestion of Non-Breast Milk Fat[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 1998, 26(1): 39-42.

[3] Lembcke B. Atemtests bei Darmerkrankungen und in der gastroenterologischen Funktionsdiagnostik (Breath tests in intestinal diseases and functional gastrointestinal diagnosis) [J]. Praxis, 1997, 36(1): 25-26.

[4] 孫蘊偉摘譯.13C標記的膽固醇酰辛醇呼氣試驗評估胰腺外分泌不足[J].國外醫學-消化系疾病分冊，1998，4(1)：249.

Xun Wenwei (Adapted translation).13C labelled cholesteryl octanoate breath test for assessing pancreatic exocrine insufficiency[J]. Inter J Dig Diseases. 1998，4(1): 249(in Chinese).

[5] Shaikh VAE, Maldar NN, Lonikar SV， et al. Th-ermotropic behavior of cholesterol linked polysaccharides[J]. J Appl Polym Sci, 1998, 70(1): 195-201.

[6] 武長城，李蘭英，張棟，等，丁二酸單膽甾醇酯的合成研究[J].天津工業大學學報，2005, 24(6): 27-29.

Wu Changcheng, Li Lianying, Zhang Dong, et al. Research on synthesis of monocholesterylsuccinate[J]. J Tianjin Polytech Univ, 2005, 24(6): 27-29(in Chinese).

[7] Jonzo MD, Hiol A,Druet D, et al. Application of Immobilized Lipase from Candida rugosa to Synthesis of Cholesterol Oleate[J]. J Chem Technol Biotechnol, 1997, 69(4): 463-469.

[8] Shimada YY, Hirota, Baba T, et al, Enzymatic synthesis of steryl esters of polyunsaturated fatty acids[J]. J Am Oil Chem Soc, 1999, 76(6): 713-716.

[9] Lentz BR, Barenholz Y, Thompson TE. A simple method for the synthesis of cholesterol esters in high yield[J]. Chem Phys Lipids, 1975, 15( 2): 216-221.

[10] Ma J, Xuan YN, Huang Y. Synthesis and Characterization of A Novel Cholesteric Liquid Crystalline Containing Carboxyl Group[J]. Chin Chem Lett, 2005, 16(1): 127-130.

[11] Nagvekar DS,Delaviz Y, Prasad A, et al. Synthesis and Properties of Cholesteryl Esters Bearing 32- and 16-Membered Crown Ethers[J]. J Org Chem, 1996, 61(4):1 211-1 218.

[12] 顧樹珍，楊新浩，華曦，等.膽甾醇酯類液晶的合成[J].化學世界，1990，7：308-311.

Gu Shuzhen, Yang Xinhao, Hua Xi, et al. Preparation of Cholesteryl Ester Liquid Crystals[J]. Chem World, 1990，7: 308-311(in Chinese).

[13] Zhang DW, Huang W, Pan GH, et al. Synthesis and characterization of non-symmetrical liquid crystals containing a cholesteryl ester moiety[J]. Chinese Chemical Letters, 2009, 20(5): 562-565.

[14] Boechzelt H, Karten B, Abuja PM, Synthesis of 9-oxononanoyl cholesterol by ozonization[J]. J Lipid Res, 1998, 39(7): 1 503-1 507.

[15] 侯秀紅，盧偉京，盧浩，等.一種辛酸-1-13C的制備方法，中國200810203350[P]. 2008-12-02.

[16] Spectrol Database for Orgcnic Compounds (SDBS數據庫)[DB].SDBS NO為7836.