雙示蹤劑Micro-PET顯像評價大鼠心肌缺血模型

萬衛星，薛楊波，王 燕，瞿凌晨，許波華，楊 敏

(1.江蘇大學附屬醫院 無錫市第四人民醫院 核醫學科，江蘇 無錫 214063； 2.南京軍區南京總醫院 核醫學科，江蘇 南京 210002； 3. 無錫江原安迪科分子核醫學研究發展有限公司， 江蘇 無錫 214063； 4. 江蘇省原子醫學研究所 衛生部核醫學重點實驗室 江蘇省分子核醫學重點實驗室，江蘇 無錫 214063)

冠心病是一種由冠狀動脈器質性狹窄或阻塞引起的心肌缺血缺氧或心肌壞死的心臟病。冠心病發病率逐年提高，且呈年輕化趨勢，據《中國心血管病報告2011》報道，截止到2011年，患冠心病人數已達2.3億，冠心病已被稱作“人類健康的第一殺手”[1]。臨床前對于冠心病心肌梗死的發生機理、防治方法等的研究，以結扎冠狀動脈的心肌梗死模型為主[2-5]，大鼠因造價低廉，飼養方便，冠狀動脈側支循環少，心肌壞死出現早，心率失常發生率高，重復性及穩定性好，成為制作心肌缺血模型的首選試驗動物[6-9]。

傳統方法評價冠狀動脈結扎法建立大鼠心肌缺血模型以心電圖出現T波改變為標準[4]。但此法存在不足：(1)由于方法本身以及手術的影響使得心功能檢測易出現多變性，個體差異較大[10]；(2)心電圖的檢測具有時效性，只能在術前和術后半小時內進行短時間檢測[11]；(3)存在一定的假陽性，與病理學心肌TTC染色驗證結果不符。模型建立的成功與否，是研究心肌缺血疾病的基礎，鑒于傳統方法評價心肌缺血模型存在一定的不足，急需尋求精準評價心肌缺血模型的方法。

血流灌注顯像劑13NH3·H2O和葡萄糖代謝顯像劑18F-FDG已廣泛應用于臨床，兩種顯像劑聯合的PET顯像是評價心肌存活的“金標準”[12-13]，可以對缺血心肌存活、預后和療效進行客觀評估。臨床上采用18F-FDG代謝聯合13NH3·H2O灌注顯像來對心肌缺血程度進行評價，本研究擬采用13NH3·H2O 聯合18F-FDG Micro-PET顯像評價臨床前心肌缺血大鼠模型，與傳統T波改變的評價方法進行比較。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

Sumitomo HM-7型醫用回旋加速器：日本住友；Sumitomo HM-10型醫用回旋加速器：日本住友；18F-FDG專用合成模塊：北京派特；Mini-Scan TLC薄層放射性掃描儀：美國Bio SCAN公司；Matrx VMR型麻醉機：美國MATRX公司；Inveon型Micro-PET掃描儀：德國SIMENS公司；CURIEMENTOR 3型活度計：德國PTW公司；ALC-V小動物呼吸機：上海奧爾科特生物科技有限公司； XD-7100型心電圖機：上海醫用電子儀器廠；AC 210S型電子天平：德國Sartorius公司；A10超純水系統：美國Millipore公司；寵物剃毛機：飛利浦公司。

1.2 主要試劑與耗材

異氟烷麻醉劑：美國 Minrad Inc公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)：美國sigma公司；水合氯醛：國藥集團化學試劑有限公司；生理鹽水：江蘇四環生物制藥有限公司；碘酒：上海利康消毒高科技有限公司；青霉素：中諾藥業(石家莊)有限公司；CM柱：美國 Waters公司；QM柱：美國 Waters公司；H216O水、H218O：上海化工研究院。

1.3 實驗動物

12只SD大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

2 實驗部分

2.1 13NH3·H2O制備

參照文獻[14-15]，稍作改進，方法簡述如下：采用Sumitomo HM-10型醫用回旋加速器，

利用16O(p，α)13N核反應，經戴氏合金(Devarda’s alloy)還原靶水，制備出13NH3·H2O的生理鹽水注射液，并經CM柱純化。活度計測定13NH3·H2O不同時間的活度，用半對數作圖法測定半衰期，計算核純度。TLC法測定產品的放化純度，展開劑為V(丙酸)∶V(丙酮)∶V(水)=1∶3∶2的氯化鈉飽和溶液，載體為薄層層析硅膠板GF254。

2.2 18F-FDG制備

參照文獻[16-18]，稍作改進，方法簡述如下：采用Sumitomo HM-7型醫用回旋加速器，通過18O(p，n)18F核反應和親核取代反應，在FDG專用模塊中全自動合成18F-FDG，產品經TLC法測定放化純度，展開劑為95%乙腈，載體為薄層層析硅膠板GF254。

2.3 大鼠心肌缺血模型的建立

參照文獻[10-11]，稍作改進，簡述如下：大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mg∕100 g)。麻醉后將大鼠仰臥位固定，頸部胸部剪毛并酒精消毒，于頸部開一小口暴露氣管，分離氣管并插管，連接小動物呼吸機(頻率48次/min，吸呼比1/2，潮氣量20 mL/kg)。于左鎖骨中線處縱向剪開胸部皮膚約2 cm，鈍性分離肌肉層，于心臟搏動最強處開胸(在2至3肋間)。充分撕開心包膜，用環形鉤將心臟提出胸腔，在左心耳根部下方2 mm處進針，6-0號絲線結扎冠狀動脈左前降支。結扎后迅速將心臟納回胸腔，縫合胸壁。拔去呼吸機，使其恢復自主呼吸。全過程無菌操作。

2.4 傳統方法評價大鼠心肌缺血模型

2.3節中，大鼠于麻醉后，參照人體相應位置，在四肢皮下插入小動物心電圖檢測儀的針電極，動態檢測建模前后肢體Ⅱ導聯心電圖。以結扎后心電圖T波改變為模型評判標準。

2.5 Micro-PET顯像

2.1節中大鼠于建模前、后均行13NH3·H2O合并18F-FDG顯像。

2.5.113NH3·H2O顯像

大鼠于Micro-PET掃描前禁食6 h，稱重后，利用異氟烷--氧氣混合氣體(1.5%)麻醉待掃描大鼠，固定于Micro-PET掃描床上，每只尾靜脈注射10 MBq新鮮制備的13NH3·H2O，注射體積為0.2 mL，注射5 min后，行Micro-PET掃描顯像，層厚0.78 mm，矩陣128*128，采集時間10 min，采集能窗350～650 keV。

2.5.218F-FDG顯像

2.5.1節中大鼠經13NH3·H2O注射后2 h注射18F-FDG進行顯像，方法簡述如下：異氟烷麻醉，尾靜脈注射新鮮制備的18F-FDG，每只10 MBq，注射體積為0.2 mL，注射后，大鼠置于恒溫麻醉艙中，維持麻醉狀態，注射后60 min，行Micro-PET掃描顯像，掃描方式同13NH3·H2O顯像。

2.5.3數據處理

13NH3·H2O 和18F-FDG 的Micro-PET掃描圖像采用OSEM 3D迭代重建，迭代2次，勾畫心肌為感興趣區，根據公式

SUVmean=衰減校正后的平均感興趣區域的放射性活度/每克體重的注射性示蹤劑注入活度

計算建模前后心肌的放射性物質標準攝取平均值(SUVmean)，缺損心肌和完整心肌的體積(VOI)及異常心肌占全心體積的百分比。

2.5.4統計學方法

利用SPSS 19.0軟件先經方差齊性檢驗，若方差齊再進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為有極顯著性差異。

2.6 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法驗證

顯像結束后，迅速剪下模型大鼠心臟，用生理鹽水沖洗，除去血污，剔除血管脂肪等心肌組織，吸取水分，稱全心重量。從心尖至心底將心臟切成1～2 mm的切片，放入濃度為2%的TTC溶液中，37 ℃水浴染色15 min，染色后洗去多余染料。梗死部分不被染色，未梗死部分呈紅色。切取梗死區稱重，計算梗死心肌占全心重量的百分比即為梗死率。

3 結果與討論

3.1 13NH3·H2O制備

經半對數作圖法測定13NH3·H2O 半衰期約為10 min，核素純度>99%，TLC質控結果顯示，13NH3·H2O產品Rf=0.7，放化純度>99%。

3.2 18F-FDG制備

18F-FDG產品TLC質控結果顯示，產品18F-FDG的Rf=0.43，其放化純度>99%。

3.3 傳統方法評價大鼠心肌缺血模型

12只大鼠在進行冠脈結扎法建立心肌缺血模型的手術結束后，立即觀測大鼠心電圖，與正常組心電圖相比(圖1a)，9只出現了T波明顯變化(圖1b)，視為結扎正確，模型成功。1只大鼠在結扎時出現室顫，未出現T波明顯改變，視為模型不成功，1只大鼠為麻醉意外死亡，1只因為急性心衰死亡。

a—正常大鼠心電圖；b—心肌缺血模型鼠心電圖圖1 心肌缺血模型鼠心電圖Fig.1 The ECG of myocardial ischemia rat

3.4 Micro-PET顯像

建模前，12只大鼠均利用血流灌注顯像劑13NH3·H2O在注射后5 min進行Micro-PET顯像，靜態掃描圖顯示12只大鼠心肌血流灌注全部正常，整個心肌攝取放射性物質13NH3·H2O均勻，心肌標準攝取平均值為3.78±0.59，Micro-PET掃描圖示于圖2a，由圖2a顯示心肌完整；利用葡萄糖代謝顯像劑18F-FDG在注射60 min后進行Micro-PET顯像，靜態掃描圖示于圖3，由圖3顯示12只大鼠心肌完整，葡萄糖代謝全部正常，心肌18F-FDG攝取均勻，心肌標準攝取平均值為2.30±0.21。

建模后的10只大鼠，利用血流灌注顯像劑13NH3·H2O在注射后5 min進行Micro-PET顯像，靜態掃描圖顯示4只大鼠心肌血流灌注顯像與建模前一致；6只心肌血流灌注異常，部分心肌攝取放射性物質13NH3·H2O明顯低于其他大部分心肌，整個標準攝取平均值為2.78±0.46(圖2b)。利用葡萄糖代謝顯像劑18F-FDG在注射60 min后進行Micro-PET顯像，靜態掃描圖顯示4只大鼠Micro-PET顯像與建模前一致，6只大鼠心肌糖代謝異常，部分心肌攝取放射性物質18F-FDG明顯低于其他大部分心肌，整個標準攝取平均值為1.65±0.21(n=6)(圖3b)。13NH3·H2O和18F-FDG的聯合顯像結果顯示，傳統方法心電圖顯示的9只建模成功的大鼠中，僅有6只發現心肌灌注和葡萄糖代謝均異常。

3.5 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法驗證

13NH3·H2O和18F-FDG 的Micro-PET圖像顯示心肌攝取異常的6只大鼠，TTC染色后圖片顯示有部分心肌呈蒼白色(圖4)，TTC、心電圖監測、Micro-PET三種評價結果一致，確認為建模成功。

Micro-PET顯像正常的4只大鼠，其中3只在建模時，心電圖出現了T波變化，但在解剖后TTC染色時，染色均勻，無異常(見圖5)；另1只在建模時，心電圖顯示無T波改變， TTC染色均勻。TTC和Micro-PET評價結果一致，心電圖評價假陽性。

心電壓評價、Micro-PET評價及TTC染色結果比較列于表1。Micro-PET方法評價大鼠心肌缺血模型成功的正確率為100%，而傳統心電圖檢測的方法評價大鼠心肌缺血模型成功的正確性僅為66.67%。

a—建模前；b—建模成功圖2 13NH3·H2O的Micro-PET掃描圖Fig.2 The Micro-PET scan picture of 13NH3·H2O

a—建模前；b—建模成功圖3 18F-FDG的Micro-PET掃描圖Fig.3 The Micro-PET scan picture of 18F-FDG

動物編號心電圖結果13NH3·H2O顯像18F-FDG顯像TTC染色SUVmean建模前建模后*灌注異常心肌體積百分比(%)SUVmean建模前建模后#代謝異常心肌體積百分比(%)梗死率(%)1+4.313.2428.362.091.6725.4645.862+3.262.3724.952.451.5228.4027.393+4.283.1918.321.961.4119.4221.874+3.693.0030.432.131.8623.8135.695+3.942.8929.611.821.4435.4646.616+2.691.9733.342.631.9821.3938.477+2.872.960.002.332.690.000.008+4.224.080.001.851.940.000.009+3.893.850.002.292.110.000.0010-3.743.810.002.312.470.000.00

注：*：與建模前相比，建模成功的6只心肌攝取13NH3·H2O有統計學差異，p<0.05；

#：與建模前相比，建模成功的6只心肌攝取18F-FDG有統計學差異，p<0.05；

圖4 心肌缺血大鼠心臟TTC染色圖Fig.4 The TTC staining picture of ischemical myocardical

圖5 正常大鼠心臟TTC染色圖Fig.5 The TTC staining picture of normal myocardical

4 小結

(1)雙示蹤劑13NH3·H2O和18F-FDG的Micro-PET顯像已經是臨床評價心肌存活的“金標準”。但此法用于臨床前動物模型的評價鮮有報道。本研究嘗試用此法評價嚙齒類動物心肌缺血模型，為建立抗心肌缺血藥物開發的Micro-PET評價平臺奠定基礎。

(2)與傳統的心電圖監測方法相比，Micro-PET顯像技術可以從分子水平、功能代謝方面評價心肌缺血，大大提高了評價方法的準確性；與TTC方法相比，Micro-PET顯像技術可實現連續、動態、活體、無創成像。

綜上所述，13NH3·H2O 聯合18F-FDG Micro-PET顯像技術在評價心肌缺血模型具有獨特的優勢和廣闊的應用前景。

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