P21 和Cyclin E在胃腺癌組織中表達及相關性研究*

王亞東 楊留才 徐紅濤 李仕紅

(1.阜寧縣人民醫院， 江蘇 阜寧 224400；2.鹽城衛生職業技術學院， 江蘇 鹽城 224005)

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，我國胃癌的發病率占惡性腫瘤的發病率的第二位，死亡率占惡性腫瘤的第三位[1]。目前的研究認為我國胃癌的發生可能和癌前病變、飲食習慣、吸煙、酗酒、幽門螺桿菌感染和家族史有關[2]。早期胃癌癥狀隱匿，患者出現自覺癥狀時往往已是中晚期，喪失了早期治療、提高生存率的機會。研究表明，P21 和Cyclin E在多種惡性腫瘤中的表達均較正常組織發生了明顯的改變，而上述兩種細胞因子均和細胞周期的調控有關[3，4]。本次研究通過檢測P21和Cyclin E在胃癌組織中陽性表達率，并且研究兩者的陽性表達之間是否存在相關性，從而試圖為胃癌的診斷和治療提供一種新的思路。

1 資料和方法

1.1病例資料收集自2009年1月至2011年12月3年間在我院普外科就診并且手術治療，并且經過病理診斷確診為胃腺癌的蠟塊標本98例作為試驗組，其中男性患者63例，女性患者35例，平均年齡(46.57±17.68)歲；按照年齡進行分類，按照國際抗癌聯盟(Union for International Cancer Control, UICC)臨床分期標準對胃腺癌患者進行分期，Ⅰ期17例，Ⅱ期23例，III期36例，IV期22例；病理診斷為高分化31例，中分化42例，低分化癌25例；術后病理診斷確認有淋巴結轉移68例，無淋巴結轉移30例，胃腺癌患者在進行手術之前均沒有經過化療等治療措施。采集病理標本均采用4%多聚甲醛進行固定，常規石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm。另外取病理診斷為正常胃黏膜的蠟塊標本34例作為對照組，標本來自于胃潰瘍切除術或者十二指腸切除術的患者，均通過病理診斷排除了高度不典型增生，其中男性患者20例，女性患者14例，平均年齡(47.23±18.49)歲。胃癌組和對照組的年齡、性別均無統計學意義。

1.2實驗方法 切片厚度為5μm，脫蠟水化后微波修復5min，3%過氧化氫孵育10min去除內源性過氧化物酶， 加兔抗人Cyclin E一抗( 1∶200, 德國Merck公司) ，兔抗人P21一抗(1∶400, 德國Merck公司)，室溫過夜，PBS清洗，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗( 1：100，美國Santa Cruz公司)室溫孵育40 min；PBS清洗，加Elite-AP(英國Vector公司)孵育15min，PBS清洗，DAB底物液(中國邁新公司)顯色3min，蘇木素復染30sec，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3染色結果判斷 染色結果顯示Cyclin E和P21均定位于胞核中，以細胞核出現棕黃色染色作為陽性。在高倍鏡(×400)下選取陽性細胞最多的5個視野，每個視野計數200個細胞，根據陽性細胞在全部組織細胞中所占比例判定實驗結果，陽性細胞數占全部組織細胞數比例<5%判斷為(-)，陽性細胞數占全部組織細胞數比例為5%～49%之間判斷為(+)，陽性細胞數占全部組織細胞比例陽性細胞數≥50%判斷為(++)，以(+)及(++)以上判斷為陽性。

1.4統計學方法 所有的數據使用SPSS13.0統計學軟件進行分析，各組樣本之間的比較采用χ2檢驗進行統計分析，Cyclin E和P21之間的相關關系采用Spearman等級相關檢驗進行統計分析，以P≤0.05作為有統計學意義。

2 結 果

2.1Cyclin E和P21在不同組織中的陽性表達情況 Cyclin E和P21在對照組和胃腺癌組中的表達情況見表1。Cyclin E在胃腺癌組中的陽性表達率明顯高于對照組，差異具有統計學意義(χ2=50.80，P<0.05)P21在對照組中陽性表達率高于胃腺癌組，并且差異具有統計學意義(χ2=38.03，P<0.05)。

表1 Cyclin E和P21在不同胃組織中陽性表達率

2.2Cyclin E和P21在胃癌組織中表達以及與臨床、病理指標關系 Cyclin E和P21在胃癌組織陽性表達情況與性別、臨床分期、病理分級和淋巴結轉移等臨床、病例指標的關系見表2。

表2 Cyclin E和P21在胃癌組織中表達以及與臨床病理指標關系

2.3Cyclin E和P21在胃癌組織表達的相關性 使用Spearman等級相關檢驗分析二者之間的相關關系，結果為r=-0.51，P<0.05，提示Cyclin E和P21在胃癌組織組織表達存在負相關。

表3 Cyclin E和P21在胃癌組織表達的相關性

3 討 論

本次研究通過免疫組化的方法來研究Cyclin E和P21在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達情況，結果顯示Cyclin E在正常胃黏膜組織中的陽性表達率明顯的低于胃癌組織，而P21在上述兩種組織中的陽性表達率正好相反，并且兩者之間的差異均具有統計學意義(P<0.05)；通過進一步分析Cyclin E和P21在胃癌陽性表達情況與性別、臨床分期、病理分級和淋巴結轉移等指標的關系，結果發現Cyclin E在胃癌中陽性表達率和性別無關，但是上述兩種細胞因子和臨床分期、病理分化程度、淋巴結是否有轉移有關，并且差異均具有統計學意義(P<0.05)。Cyclin E 是一種重要的細胞周期調節蛋白，能夠有效的促進細胞周期，是一種正性的細胞周期調節因子[5]。目前的研究表明Cyclin E在G1 期能夠和細胞周期調節素依賴性激酶2(Cyclin dependence kinase 2; CDK2)結合，并且使CDK2活化，活化的CDK2能夠使得視網膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma; Rb)磷酸化，磷酸化的Rb蛋白能夠活化轉錄因子E2F，促進DNA合成，促使細胞由G1 期進入S 期，從而加速細胞增殖[6，7]。而P21 是一種細胞周期負性調節因子，也是一種抑癌基因，在正常細胞周期中， P21 的功能是抑制CDK2、CDK4和CDK6等細胞周期調節素依賴性激酶被磷酸化，從而抑制Cyclin E/CDK2、Cyclin E/CDK4等復合物的活性，從而使得Rb不能磷酸化，進而使得E2F不能被活化，阻止細胞進入S 期，從而阻斷細胞周期[8，9]。我們的研究表明，P21在正常胃黏膜組織中的陽性表達率明顯的高于胃癌組織，并且在臨床分期晚、低分化和有淋巴轉移的組織中的陽性表達率明顯的低于臨床分期早、高分化沒有淋巴轉移的組織，并且差異均具有統計學意義(P<0.05)。現有的研究表明，P21表達水平下降或者P21基因發生突變，即由野生型P21變為突變型P21，都能夠導致對Cyclin E/CDK2、Cyclin E/CDK4等復合物抑制減少，進而導致細胞周期過快運行，細胞增殖明顯增加，進而導致腫瘤的發生[10]。

本研究還顯示Cyclin E與P21在胃癌中的表達呈負相關，提示P21可能通過影響Cyclin E的表達水平來調控細胞的凋亡，其主要的作用機制在于P21能夠通過直接抑制Cyclin E/CDK2復合物的活性，推遲細胞從G1期進入S期。而P21表達水平下調則會減少Cyclin E/CDK2復合物的抑制作用，從而刺激細胞增殖，導致腫瘤的發生[11]。

我們的研究結果表明，Cyclin E在胃癌的組織中陽性表達率高，并且其表達水平和臨床分期、病理分級以及淋巴結轉移相關；P21在胃癌的組織中陽性表達低，并且其表達水平和臨床分期、病理分級以及淋巴結轉移相關；Cyclin E和P21在胃癌的組織負相關，提示Cyclin E和P21胃癌的發生起到了協同作用。

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