“成血管化”對組織工程骨成骨的影響

馮 琳 劉洪臣

在臨床工作中，骨移植術一直用于修復由創傷、腫瘤、感染所造成的大范圍骨缺損的傳統方法，并成為修復骨缺損的“金標準”。如何提高成骨質量，成骨速度成為當前組織工程骨研究的熱點與難點。

目前修復骨缺損的方法有以下幾種：自體骨的移植；異體骨的移植；人工替代物替代；組織工程骨的植入。前3 種方法已在臨床中已使用多年，雖然經不斷改進，但仍存在不少缺點。隨著組織工程技術的不斷發展，組織工程骨有望成為修復大段骨缺損的理想方法，因此也成了目前治療骨缺損研究的熱點。[1-3]

關于組織工程骨的研究己證明，用組織工程化骨修復小的骨缺損時，其早期的成骨程度及后期的骨愈合效果均非常良好。但是，應用大塊的組織工程化骨修復大段的骨缺損時，其中心的部份經常因缺血而發生壞死。同時，天然骨的存活和生長主要是由于其自身周圍及內部豐富的血液供應，可以為其提供各種營養物質、活性生長因子及氧等，同時也可以及時排出其內部及周圍的各種代謝廢物。通過這種現象也可以說明，在實施骨組織工程技術修復骨缺損，尤其是大面積骨缺損的過程中，在新生的骨組織形成之前構建血供系統是極其重要的一步。因此，骨組織移植物的血管化成為組織工程骨修復骨缺損的關鍵環節之一，其已被認為是骨組織工程繼種子細胞、支架材料、細胞因子三大要素之后的又一重要因索[4，5]。

本文就血管生成基本過程，有關細胞，因子等以及促進組織工程骨成血管化的方法分別予以敘述。

1. 血管生成基本過程

血管生成是一個包括細胞、生長因子、細胞外基質、生物力學刺激等多因素相互作用的復雜過程，其基本過程包括：

1.1 血管新生啟動階段 在缺氧時或某些細胞因子作用下，以血管通透性增加為特征。

1.2 進展階段 蛋白水解酶降解細胞外基質，脫離并穿過血管壁進入細胞外基質，形成結節狀或錐體狀血管芽。

1.3 形成階段 單個血管芽生長變形形成血管腔，并與鄰近血管芽相互吻合成血管網。

1.4 塑形和改建階段 血管平滑肌或其他細胞遷移包繞新生血管，產生細胞外基質，進而形成完整的血管壁結構，待創傷愈合后，部分新生血管將蛻化[6]。

2. 構建組織工程骨血管化的有關細胞

2.1 血管內皮祖細胞 EC(Endothelial Cell 血管內皮細胞)是血管壁內層的基本結構，是保證血管正常結構、維持通透性的必要成分，內皮損傷會形成血栓，甚至導致血管完全堵塞。因此，構建組織工程化血管必須首先選擇合適的內皮細胞Kofron[7]等將幾種內皮祖細胞與膠原凝膠體外聯合培養， 發現循環血中的 EPC (Endothelial Progenitor Cell 血管內皮祖細胞)生成毛細血管網能力最強。進一步EPC 研究表明，為了發揮EPC的復制潛力，可以借助聚合酶，經人類逆轉錄酶轉染的方法異位表達內皮細胞，以延長成體細胞的壽命，形成缺血區的動脈血管網。

2.2 平滑肌細胞 直徑為0.2mm 以上的血管尤其是動脈血管均有平滑肌結構，它是維持血管彈性和功能的成分，屬于血管的中層結構。組織工程技術己試圖將SMC (Smooth Muscle Cell 平滑肌細胞)與EC 復合培養構建小血管。Cho[8]等分化出SMC，與EC 復合培養并修補狗下腔靜脈壁。3 周后，經大體觀察、組織學切片和熒光標一記檢查，證實細胞均成活良好，血管壁光滑無血栓形成，內壁有完整的內皮細胞生長覆蓋。目前，SMC 主要來源于骨髓或脂肪，也可取自較大靜脈血管壁和臍動脈血管壁。

3. 促組織工程骨血管化的有關因子

生長因子是血管形成中最核心和最復雜因素。通過基因缺陷和受體突變模型等方法己分離出38種促血管因子和46 種血管形成抑制因子。促血管生成因子主要為血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、血管生成素、血小板衍化生長因子、轉化生長因子、肝細胞生長因子、表皮細胞生長因子等。

3.1 血管內皮細胞生長因子 VEGF (Vascular Endothelial Grow th Factor，血管內皮細胞生長因子)為糖蛋白家族，包括6 大成員，分別為血管內皮細胞生長因子- A、B、C、D、E 和胎盤生長因子。為血管生成初期最重要的促進因子，具高度保守性，是血管內皮細胞高度特異性的生長因子。Liu 等[9]發現梯度VEGF 可以刺激體外培養的內皮細胞定向移動，利于生物材料內部血管形成。

3.2 成纖維細胞生長因子 成纖維細胞生長因子FGF 家族和血管內皮細胞生長因子均是經過臨床證實具有促血管生成活性的細胞因子。Jansen等[10]將復合FGF- 2 的膠原支架種植于大鼠粘膜骨膜下，發現1 周和2 周時細胞密度及新生血管數量均有明顯增加。它既是成纖維細胞有絲分裂原，也是內皮細胞趨化因子，可有效促進血管生成。其作用可能是間接通過血管內皮細胞生長因子及受體而起作用。

3.3 轉化生長因子- β 轉化生長因子- β(TGF- β)在體外抑制內皮細胞增殖，但對體內血管形成作用有促進作用，可能是通過招募巨噬細胞和成纖維細胞并分泌血管生成相關因子而發揮穩定血管壁作用。Zhu 等[11]將內皮前體細胞與轉染TGF- β 的平滑肌細胞(實驗組)共培養21 天，發現實驗組平滑肌高表達VEGF，內皮細胞集落明顯增多，內皮前體細胞和平滑肌細胞間的粘合力比對照組明顯增高，證明TGF- β 轉染的平滑肌細胞有助于內皮細胞粘著和分化有利于血管生成。

3.4 血管生成素 ANG(Angiopoietin，血管生成素)，包括血管生成素l,2,3,4(Ang1,2,3,4),與血管生成素關系密切的是Ang- 1 和Ang- 2，均與Tie- 2 受體結合。Ang- 1 特異性作用于血管內皮細胞表面的，在肌肉、子宮等血管豐富組織內廣泛表達，特異性作用于血管內皮細胞表面的Tie- 2受體，促進受體自身磷酸化；表達活化Tie- 2 的內皮細胞，吸引血管平滑肌細胞，周細胞等血管周圍細胞包圍支持內皮細胞，形成完整血管壁，促進血管重塑、成熟；在成熟血管中，Ang- 1 還增加內皮細胞和周細胞間連接，維持內皮細胞靜息狀態的血管完整性，抑制內皮細胞調亡，促進血管損傷后再內皮化。Ang- 2 是Ang- 1 的拮抗劑，在內皮細胞競爭、抑制Ang- l 引起的Tie- 2 磷酸化反應及內皮細胞趨化作用，使血管變形和消退。對于成人而言，Ang- 1 與Tie- 2 受體共同保持血管穩定，而血管生成素Ang- 2 的上調可打破這種穩定狀態，在這種條件下內皮細胞不再附著于周細胞及細胞外基質，而是在血管生成信號的作用下產生血管形成用。[12]

3.5 血小板衍化生長因子 血小板衍化生長因子可在體內誘導血管形成，但不直接影響內皮細胞增殖，在創傷愈合過程中起促進形成功能性血管的作用。血小板衍化生長因子受體的表達只位于部分內皮細胞上，大部分是形成過程中的內皮細胞管及微血管內皮細胞，但靜息期內皮細胞表面無表達。目前認為血小板衍化生長因子在血管形成的后期起作用，是成纖維細胞和平滑肌細胞生長遷移的刺激劑，但對內皮細胞和神經細胞的作用并不顯著。

3.6 骨形成蛋白 BMP(Bone Morphogenetic Protein 骨形成蛋白)不僅具有較好的骨誘導活性，而且能上調成骨細胞中VEGF 的表達，具有顯著的促血管生長作用。而VEGF 亦能調結成骨細胞的活性，使之能更好的分泌細胞基質從而促進成骨[13]。Bouletreau 等[14]認為，在骨缺損修復過程中，成骨細胞表達VEGF，其促進內皮細胞的分裂增殖，進而促進血管形成，同時VEGF 促進內皮細胞表達BMP- 2，BMP- 2 作用于成骨細胞，一方面可提高VEGF 的表達，另一方面可以促進骨再生；兩者之間形成一個正反饋調節。李建軍等[15]發現BMP- 2基因轉染使人骨髓基質干細胞血管內皮細胞生長因子表達增加，但是骨形態發生蛋白是否有促血管形成作用目前尚有爭議。

3.7 其他因子 其他因子如胰島索樣生長因子、肝細胞生長因子等，他們的促血管形成機制尚不完全清楚。

3.8 促血管生長因子在組織工程組織血管化中的應用促血管生長因子促進血管形成，可以加速血供，但在實際應用中存在下列問題：因子半衰期過短，代謝降解過快，不能持續足夠時間。因子易被代謝流失不能在局部形成有效濃度，因此，目前已從血管生成因子治療技術向基因治療技術方面發展。

4. 促進組織工程骨血管化的方法

目前促組織工程化骨血管化的技術主要有6 種

4.1 包裹血管束法 Vacanti[16]等將復合有成骨細胞的可降解材料包裹體內血管束，由血管束長出毛細血管深入材料內，形成帶血管蒂的人工骨，再用于移植。

4.2 預構帶血管蒂的組織工程化骨肌骨瓣法Levin[17]等根據骨缺損區形狀與大小設計好羥基磷灰石HA 支架材料，骨形態發生蛋白復合物HA+BMP植入帶有軸心血管的肌肉組織內，4 周后預構成帶血管蒂的組織工程化骨肌骨瓣，再將其植入自體骨缺損區。

4.3 帶血管蒂筋膜包裹法 植入組織工程化骨時，就近選擇帶血管蒂的筋膜瓣包裹移植物，使其表面彌漫的毛細血管能夠從各個方向長入移植物內。[18]

這些方法是借用體內已經存在的血管條件來促進人工骨的血管化，手術效果明確；但存在增加機體額外創傷、受局部血管條件限制等缺點，從而限制了其臨床推廣應用。

4.4 應用血管內皮細胞EC 將EC 聯合成骨細胞與支架材料復合，使EC 作為血管生成的種子細胞，在體內成骨活躍的微環境中發生毛細血管化，使材料內形成彌漫性的內源性微血管網，并與宿主血管系統建立吻合[19]。由于成骨細胞與EC 在體外聯合培養時，相互促進功能蛋白的表達，從而為該技術的進一步研究奠定了基礎，但作為種子細胞的來源較困難，自體細胞不易獲取，體外擴增能力有限，異體細胞存在免疫原性而較難應用。

4.5 應用促血管生成的生長因子 如采用生長因子緩釋技術將血管內皮細胞生長因子VEGF 吸附于支架材料內，或者通過基因轉染技術促進細胞進入體內后大量分泌，依靠局部較高濃度的VEGF促進微血管生成[20]。目前這類方法也存在不足，如VEGF 與材料在復合制備時，現有技術往往造成其生物活性大大下降，另一缺點是VEGF 局部含量不易調控，由于生長因子對血管生成的作用是網絡式的序貫作用，因此單一因子的低含量作用效果是有限的，而高含量VEGF 作用有誘發血管瘤的危險。

4.6 聯合應用法 也有將上述方法部分聯合應用的嘗試，以最大限度的提高血管化的速度，如楊志明[21]等植入由復合材料、rhBMP、成骨細胞制備的組織工程化骨，修復兔骨缺損時，發現人工骨包裹帶血管蒂筋膜及復合EC 的方法具有明顯的促血管作用，其效果強于人工骨單純復合EC 或單純包裹帶血管蒂筋膜的方法。

5. 血管化對組織工程骨成骨的作用

5.1 大塊組織工程骨組織的血管再生，依靠周圍組織血管長入速度太慢，所需時間較長，可能在尚未建立新的血循環之前，復合在材料上的成骨細胞已死亡。金丹等[18]在骨組織工程實驗研究中分析證實影響骨組織再生成功與否的決定因素是移植物的再血管化。體外培養構建的組織工程化骨組織復合物，其營養供應模式是培養液—細胞，植入體內后則變為血液- 細胞間液- 細胞。營養供應方式的改變勢必影響復合物中細胞的增殖、分化和分泌功能，造成成骨能力下降。因此，盡早建立血運，才能更多保留復合物的成骨活性。王坷等[22]在組織工程骨植入大型動物體內的實驗中發現，材料細胞復合體的中心部分雖然也復合了細胞，但并未成骨。分析原因，可能是材料中心缺乏種子細胞所需的液體交換條件，而血管血供又無法在短期內長入，提示大體積組織構建中血管和血液供應的重要性。如同其它組織移植一樣，組織工程骨也面臨植入后迅速血管化的關鍵問題[23]。只有盡早建立血運，才能更多保留復合物的成骨活性，保證組織工程骨再生成功。Sahota 等[24]認為組織工程植入物失敗的主要原因在于血管化的遲滯，因此如果不能建立有效第三部分血管束與感覺神經束聯合構建血管神經化組織工程骨作用研究血循環，組織工程材料的制作只能被限制在薄、小的程度。

5.2 Hanahan[25]認為血管生成受血管生成促進因子和血管生成抑制因子的共同調控，生理狀況下血管生長受到嚴格調控，當正負調控因子失去平衡時則會出現病理性血管生成。促進血管生成的因子主要VEGF(血管內皮細胞生長因子)、bFGF(basic Fibroblast Grow th Factor，堿性成纖維細胞生長因子)、ANG(血管生成素)，PDGF (Plateler-Derived Grow th Factor，血小板衍化生長因子)，TGF- β(Transform ing Grow th Factor- β，β- 轉化生長因子)，EGF(Epidermal Grow th Factor，表皮細胞生長因子)等，抑制血管生成的因子有血管抑素、內皮抑素、血小板因子- 4 等[26]，VEGF 能誘導血管形成在骨牽張過程中血管形成和基質礦化有著密不可分的關系，VEGF 可通過增強血管內皮細胞和前成骨細胞的增殖和分化而加速骨形成，其中VEGF 是較特異地作用于EC 的多功能細胞因子，具有高度保守性，兩個相同亞基以二硫鍵交聯結合成二聚體糖蛋白。它是血管生成初期最重要的促進因子：首先，通過肝素樣分子的調節，VEGF與相應受體結合引起受體自身磷酸化，激活絲裂原活化的蛋白激酶，選擇性增強，有絲分裂，刺激EC 增殖并促進血管生成；此外，升高血管尤其是微小血管的通透性，為細胞的生長和新生毛細血管網的建立提供營養[27]。最近對VEGF 的調控機制研究發現，細胞在低氧含量或某些癌基因產物作用下可產生缺氧誘導因子- 1(Hypox ia- Inducible Factor 1，H IF- 1)，它是一種轉錄因子，可明顯促進VEGF 基因的表達，促進VEGF 的生物活性[28]，包括120ku 的α 亞基和91- 94ku 的β 亞基，β 亞基與細胞的多種功能有關，而α 亞基則僅與O2 能量代謝有關，調控的靶基因包括VEGF、促紅細胞生成素(Epo)、PDGF、bFGF、NO、內皮素- 1 等，相應的產物協同作用，從而改善缺氧態，Reyes[29]等發現骨髓來源的間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem，BMSCs)不僅誘導產生成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等，而且在VGEF- B 作用下，還可以向血管母細胞、EC 表型分化，表達CD34、CD31、Ⅷ因子等。

5.3 Nom i[30]等介紹了在工程化組織中復合血管化因子、植入內皮細胞和在復合細胞前基質材料進行預血管化處理等血管化構建方法。裴國獻[31]強調組織工程骨血管化的重要性，主張用各種方法重建組織工程骨的血液循環，介紹了顯微外血管束植入技術、筋膜瓣包裹術在組織工程化骨組織再血管化中的應用和植入病損區前在身體適當部位對組織工程骨進行血管化預構技術的應用價值。Hokugo等[32]用生物可吸收膜將自體松質骨顆粒復合骨髓后包裹在隱血管束周圍進行異位成骨試驗，三周后觀察到有新骨形成，并在骨組織中看到有新生血管穿過。

5.4 帶血供骨移植體帶有相當數量的有生命活力的細胞與基質成分，能促使更快地與宿主骨融合。更重要的是作為一塊有生命的組織，能與宿主即刻建立血管化聯系，使其能夠通過自身同宿主一致的神經、體液調節系統，較快納入與宿主一致的生理反饋模式中，成為機體的有機組成部分，進而成為一個完整意義上的有生命的組織，能更積極地對內、外環境中各種因素變化(包括營養狀態、應力刺激等)作出同機體整體功能相適應的反應。這對于構建有生命活性的組織工程化人工骨是一個重要啟發。已經證實，促進組織工程骨內的血管再生、加快組織工程骨的血管化過程可以提高成骨速度與成骨質量[33]。

綜上所述，現行的組織工程骨構建方法多僅使用單純成骨細胞接種，使之雖然能夠成骨，但無論從形成新生骨組織的數量還是質量上來講均不能滿足臨床修復大范圍、長段骨缺損的需要。因此如何在構建組織工程化骨組織的同時，促進小血管的長入以及細胞與材料復合物內血供的重建就成為骨組織工程由基礎向臨床應用的關鍵性環節。同其他類型移植骨一樣，充分的血液供應是保證組織工程骨組織體內存活的決定性因素。如何在構建組織工程骨組織的同時重建其血液供應，已成為骨組織工程從基礎研究向臨床應用過渡的關鍵性問題。小塊組織工程骨植入體內后，早期依靠組織液可獲得營養，大塊或管狀組織工程骨僅靠組織液滲透營養是不完全的。因此，研究組織工程骨血管化構建技術具有十分重要的意義。大量的基礎實驗和臨床應用研究證實影響骨組織再生成功與否的決定因素之一是成血管化。

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