銜接分子胱天蛋白酶募集域蛋白9與抗結核免疫的相關性

孫蕾 鄭錦輝 王毳 費思平 趙卓

結核病是一種慢性傳染病，全球每年約有170萬例患者死于結核感染［1］。我國結核病患者例數居世界第二位，也是耐藥結核病流行嚴重的國家之一，因結核病死亡的人數超過其他傳染病死亡人數的總和。因此，研制有效的抗結核藥物和新型疫苗迫在眉睫。這需要對宿主與Mtb相互作用機制、抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）內部信號傳導機制及其關鍵分子進行深入理解。

Mtb進入人體后，Mtb表面病原體相關分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）被模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別［2］，巨噬細胞、樹突狀細胞和上皮細胞均表達PRRs［3］。PRRs與PAMPs結合后，PRRs將信號傳遞給銜接分子，后者啟動下游的信號級聯反應，誘導固有免疫細胞合成細胞因子，活化宿主免疫。一個銜接蛋白可接受多種受體的信號，因此，銜接蛋白在宿主免疫中起著關鍵作用。胱天蛋白酶募集域蛋白 9（caspase recruitment domain－containing protein 9，CARD9）能識別多種Mtb受體［4］，在抗結核免疫中發揮著重要作用。以下僅對CARD9及其在抗結核免疫中的作用機制進行簡要闡述。

CARD9的結構與分布

CARD9屬于CARD蛋白家族，位于染色體9q34．3，cDNA全長2108bp，編碼536個氨基酸殘基，合成相對分子質量為62 300的蛋白質。CARD9有2個功能區，一個位于CARD9的N末端，為胱天蛋白酶募集域，有7～98個氨基酸殘基。另一個位于C末端，由7肽重要特征的卷曲螺旋域組成，至少有3個氨基酸殘基段，分別為140～230、243～277、332～419的卷曲螺旋域，這個區域對于蛋白的寡聚化功能具有重要作用［5］。CARD9在多種組織中表達，包括肺、肝、脾、子宮、外周血和骨髓。CARD9在骨髓源細胞中表達，如樹突狀細胞（dendritic cell，DC）和骨髓源巨噬細胞（bone marrow－derived macrophages，BMDMs）等，而在淋巴結和T、B細胞中不表達［3］。

CARD9在抗結核免疫中的作用

一、CARD9是傳遞多種識別Mtb相關受體信號的中心分子

Mtb細胞壁表面包含大量結構不同的分子，分別由不同的PRRs識別。含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine－based activation motif，ITAM）的受體與相應配體作用后，活化銜接分子CARD9，CARD9與Bcl10／Malt1信號作用模塊結合，形成三分子復合體，將信號傳導給轉錄因子NF－κB途徑［6］。銜接分子CARD9與多個信號途徑有關，是多種識別Mtb受體下游的中心銜接分子。CARD9選擇性接受來自BMDMs的dectin－1受體、NOD2（nucleotidebinding oligomerization domain－containing protein 2）類受體和巨噬細胞誘導性C型凝集素樣受體（MINCLE）的信號，與脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）和（或）CARD9相關的受體對控制Mtb的固有免疫至關重要［7］。上述受體分別與抗結核的前炎癥反應、誘導少量腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）釋放和誘導少量細胞活化有關。

二、CARD9是控制結核固有免疫的重要分子

作為傳遞多種識別 Mtb受體信號的中心分子［8］，CARD9是控制結核病必不可少的。Mtb的大量繁殖和過度的炎癥導致感染結核CARD9敲除（CARD9－／－）鼠的死亡，同時，依賴CARD9的中性粒細胞又是控制結核固有免疫所必須。強調了固有免疫在結核保護和病理中的雙重作用。細菌繁殖和炎癥控制對疾病的預后有決定性作用［4］。

（一）CARD9缺陷導致Mtb感染鼠嚴重的炎癥反應

在感染Mtb前3周，CARD9－／－鼠體內出現更高的菌濃度，肺部浸潤大量中性粒細胞，肺實質細胞死亡率增加，肺實質死亡細胞清除減弱，肉芽腫形成減少，致死性病理過程伴隨以加速的炎細胞積累為特征的嚴重炎癥反應［4］。

1．Mtb感染CARD9－／－鼠肺部大量中性粒細胞浸潤的機制：Mtb感染CARD9－／－鼠的肺部損傷以中性粒細胞炎癥和繼發性壞死的細胞凋亡為特征，這些病理特征與局部合成粒細胞集落刺激因子（G－CSF）、角化上皮來源的化學因子（keratinocyte－derived chemokine，KC）、單核細胞趨化蛋白－1（MCP－1）和系統釋放G－CSF有關。這些細胞因子由BMDMs、內皮細胞和上皮細胞合成，進而刺激粒細胞合成，并招募粒細胞到感染組織部位。

在感染期間，KC的合成增強，不成熟粒細胞被釋放到外周。G－CSF刺激中性粒細胞分化成熟和功能活化。G－CSF和KC刺激、趨化骨髓來源的粒細胞移動到感染部位。CARD9－／－鼠體內，促進中性粒細胞分化和招募的MCP－1和細胞因子升高，誘導粒細胞到達外周，KC加速招募粒細胞到肺部。因此，在感染組織部位能檢測到多形核中性粒細胞（polymorphonuclear，PMN）轉錄，CARD9－／－鼠血清中粒細胞來源的髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）濃度增加。

CARD9是Mtb感染的PMN合成白細胞介素－10（interleukin－10，IL－10）必不可少的［4］。CARD9－／－鼠IL－10缺 失使其對各種細胞因子和化學因子的負反饋喪失，IL－10負反饋調節的缺乏導致粒細胞炎癥的惡性循環和無效的凋亡細胞清除，增加了炎癥反應。

2．大量中性粒細胞浸潤是導致Mtb感染CARD9－／－鼠死亡的關鍵因素：為了解中性粒細胞浸潤對CARD9－／－鼠生存的影響，采用兩種治療方法并進行評估。第一種治療方法用洛伐他汀治療 Mtb感染CARD9－／－鼠，加速除去肺部的凋亡細胞，緩解凋亡細胞引起的繼發壞死，減輕組織損傷。第二種治療方法用抗體中和G－CSF，調節炎癥反應。對兩種治療方法進行評估，前者不能改善CARD9－／－鼠生存，而后者能有效延長Mtb感染CARD9－／－鼠的生存時間，改善肺部炎癥，減少肺部炎細胞，降低血液中粒細胞水平和MPO濃度。因此，限制炎癥和肺部粒細胞浸潤是延長Mtb感染CARD9－／－鼠生存時間的關鍵。中性粒細胞在肺部積累的程度與疾病的嚴重程度平行，也證實中性粒細胞在疾病的致死性結果中起關鍵作用［4］。

在結核感染急性期，清除PMN或中和G－CSF有利于改善CARD9缺陷條件下粒細胞的病理功能。CARD9－／－鼠中，抗Gr－1抗體（淋巴細胞抗原6G抗體）的治療能影響Gr－1＋的單核細胞，延長CARD9－／－鼠的存活時間。盡管除去PMN和減輕炎癥能延長CARD9－／－鼠存活時間，但不能明顯影響肺部的細菌量，表明炎癥能夠單獨導致CARD9－／－鼠死亡。CARD9－／－鼠的巨噬細胞感染Mtb后，合成的一氧化氮（nitric oxide，NO）量 與 對 照 細 胞相同。在 體 內，CARD9－／－鼠感染Mtb后，表達抗菌效應分子的能力未被削弱，表明抗菌效應分子不是導致CARD9－／－鼠對 Mtb敏感度增加的原因。

3．大量中性粒細胞浸潤導致Mtb感染CARD9－／－鼠死亡的原因：Mtb感染的CARD9－／－鼠中，繼發壞死導致的間接損傷和MPO的系統釋放是影響小鼠生存的關鍵因素。中性粒細胞釋放壞死滲透酶和毒性因子，這些物質損傷外周組織，而對Mtb沒有作用。粒細胞釋放的MPO對肺泡巨噬細胞具有細胞毒性，活動性肺結核患者血中MPO水平增加［9］。

（二）CARD9缺陷影響Mtb感染的APC分泌細胞因子的能力

Mtb感染中，CARD9對巨噬細胞分泌細胞因子起到至關重要的作用。用 Mtb感染 CARD9－／－的 BMDMs和DCs，這兩種細胞將病原體內在化的能力和消除凋亡細胞的能力與對照細胞相比沒有削弱，但CARD9－／－的BMDMs合成前炎癥細胞因子TNF、白細胞介素－6（IL－6）和血清趨化因子5（CCL5）能力減弱，合成白細胞介素－12（IL－12）減少，釋放白細胞介素－1β（IL－1β）缺陷［4］。CARD9能通過IL－1β的釋放環節影響其釋放，從而調節炎癥。低水平IL－1β誘導遲發中性粒細胞反應［10］。TNF合成減少與肉芽腫形成減少有關［11］。CARD9缺陷減少轉錄因子 NK－κB的核移位［12］，趨化因子CXCL2（MIP－2）的啟動子含有 NF－κB的結合部位［13］，使得 MIP－2合成下調。IL－6合成的減少能直接減少趨化因子CXCL1（KC）的合成。

（三）CARD9缺陷影響宿主固有免疫，而非獲得性免疫

檢測Mtb感染CARD9－／－鼠肺部T細胞亞群、CD4＋T細胞和CD8＋T細胞的比例，以及T細胞功能，CARD9－／－鼠與對照鼠差異無統計學意義。兩者對Mtb產生相同程度的遲發型超敏反應，并且卡介苗誘發的保護性免疫相同，T淋巴細胞合成的細胞因子量一致。因此，獲得性免疫不受CARD9缺陷影響［4］。

CARD9的缺陷不影響T細胞對 Mtb的反應。CARD9－／－鼠在感染Mtb后，體內Th1反應正常。細菌表面布滿各種PAMPs，這些分子模式同時激活多種PRRs，Mtb被多種受體識別并不受單一受體配體反應的限制。因此，盡管Syk－CARD9途徑參與合成IL－17的CD4＋T細胞的分化，Th17對Mtb的應答沒有任何缺陷。結核亞單位疫苗佐劑核心因子正6，6－二霉菌酸海藻糖（索因子）［trehalose－6，6′－dimycolate（cord－factor），TDM］和其合成類似物6，6－二十二酸酯海藻糖（trehalose－6，6′－dibehenate，TDB）依賴 于 MINCLE 和Syk－CARD9信號途徑活化巨噬細胞，通過固有免疫發揮佐劑活性［14－15］。盡管獲得性免疫未受到影響，CARD9－／－鼠仍然存在嚴重的固有免疫缺陷。CARD9缺陷的條件下，炎癥得不到控制。

結論與展望

Mtb或疫苗進入人體，與APC相互作用，產生細胞因子，誘導人體產生免疫應答。免疫應答的強度與患者的預后密切相關，產生免疫應答的相關分子機制倍受關注。固有免疫細胞活化及其細胞因子的分泌是決定機體免疫應答重要而關鍵的環節。對APC的信號傳導機制及其關鍵信號分子的研究具有重要意義。

作為多種受體的中心分子，CARD9在調節宿主抗結核感染的固有免疫中發揮重要作用。在體外，銜接分子CARD9缺陷削弱Mtb感染APC合成、分泌細胞因子的能力。在體內，CARD9－／－鼠出現以大量中性粒細胞浸潤和肺部過度炎癥為特征的病理表現。Dectin－1、NOD和 Mincle等受體均可通過銜接分子CARD9傳遞信號，這增加了宿主的脆弱性。探討Mtb感染后宿主免疫細胞的信號傳導機制及其關鍵分子的作用機制和CARD9多態性與宿主對Mtb易感性間的關系有助于深入理解結核病患者的發病、病程和預后，為患者制定個性化的治療方案。

目前，臨床主要進行Mtb及其耐藥性的檢測工作，缺少患者機體免疫對病程和預后影響的相關指標。通過對CARD9在抗結核免疫中作用機制的探討，可以找到影響患者預后的免疫指標，并采取相應治療措施，改善患者預后，延長患者生命。此外，CARD9在結核亞單位疫苗佐劑發揮活性中起到重要作用，對CARD9的研究可為開發結核疫苗奠定相關的基礎。

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