Gadd45在惡性腫瘤中的研究進展

王 赟，季洪亮

（哈爾濱醫科大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱150001）

Gadd45與DNA損傷修復密切相關，全稱為生長阻滯與DNA損傷誘生蛋白45（growth arrest and dNA damage inducible protein 45，Gadd45），其基因家族屬于p53和BRCA1的下游靶基因，在細胞生存及細胞凋亡中發揮重要作用。Gadd45家族由Gadd45α、Gadd45β和Gadd45γ三個成員組成，它們的基因排列序列非常相似，通常會在環境損傷因子作用下，隨DNA修復過程的啟動而誘導產生。電離輻射及紫外線照射等多種損傷因素可快速誘導產生Gadd45α，Gadd45α受p53與BRCA1的調節，主要通過調控細胞周期監測點及維持基因組穩定等過程來抑制細胞的轉化和惡性腫瘤的進展。Gadd45β主要通過對p53和JNK的調控從而抑制細胞的生長及細胞的凋亡過程。Gadd45γ可在電離輻射、紫外線照射等基因損傷因子誘導下呈上調表達，受p53蛋白的調控，對細胞的生長有負向調控作用，抑制細胞增殖的同時可促進其凋亡。Gadd45基因不僅與細胞生存與凋亡密切相關，而且還參與細胞的轉化和腫瘤形成過程，其在細胞的不同狀態下發揮不同甚至相反的作用。

1 Gadd45在細胞損傷反應中的作用

Gadd45家族的同源蛋白在細胞損傷反應中起重要作用。Gadd45基因編碼一組18kDa進化性保守的蛋白 ，且相互間高度同源性。這些蛋白是強酸性的，同時存在于細胞質和細胞核中。Gadd45α，最初命名為Gadd45，克隆自紫外線照射的中國倉鼠卵巢細胞中，是重要的生長阻滯和DNA損傷修復（gadd）基因。Gadd45β，最初命名為 MyD118，自M1原始粒細胞性白血病細胞經分化誘導物治療后的蛋白中分離而來，是骨髓分化初級應答基因（MyD）之一。Gadd45γ是應用 MyD118（Gadd45β）cDNA探針克隆而來，是白介素2（IL2）促進的T細胞中早期快速反應基因。

在鼠的多個組織，每一個Gadd45基因的表達水 平 均 不 相 同。 此 外，Gadd45α、Gadd45β 和Gadd45γ的表達受多種環境和生理損傷的誘導，這些損傷包括甲基甲磺酸（MMS）、電離 輻射（IR）、紫外線輻射（UV）、VP－16、柔紅霉素和炎癥因子［1］等。所有病例中，患者表達Gadd45基因均是唯一的，這與每一個Gadd45家族成員對特定的損傷產生反應相一致。由于這些特定的表達形式，每一個Gadd45基因的表達調控都是唯一的。例如，Gadd45α是p53的靶基因，因此它的誘導是p53依賴性的；Gadd45β是IL－6和 TGF－b的初級反應基因，而Gadd45γ則是IL－2和IL－6的初級反應基因［2］。

Gadd45蛋白參加由環境和生理損傷引起的細胞周期停滯、DNA修復、細胞凋亡，同時在發育和致癌過程中也起重要作用。在細胞周期調節和細胞對損傷的反應中，Gadd45可以與配體蛋白相互作用，同時可以調節配體蛋白的結構/功能。這個生物學作用高度依賴與損傷的形式，強度和細胞的種類［3］。可以和Gadd45相互作用的蛋白有PCNA、組蛋白、cdk1、p21、MEKK4、MKK7以及p38。Gadd45蛋白與PCNA和/或組蛋白的相互作用可能在修復調節DNA去甲基化激活的基因中起重要作用［4，5］。與cdc2/細胞周期蛋白B1復合物的相互作用可以抑制該復合物的激酶活化從而導致細胞周期G2/M停滯。當Gadd45α與p21相互作用時，可以增加它的CDKI活性，從而導致G1期停滯。Gadd45與MEKK4和p38聯合可導致它們的活化。MEKK4的N端可以與它的C端末端裂片結合，從而抑制C端激酶區域，而Gadd45與MEKK4的N端Gadd45結合位點結合后可以破壞這個N－C結合，引起激酶的活化［6］。Gadd45蛋白還通過與上游激酶調節子相互作用來活化或抑制JNK 活性［7，8］。Gadd45β是內源性NF－κB抑制凋亡的主要影響因素，這種調節存在于多個細胞系。在成纖維細胞中，這個調節機制包括通過與ATP激酶直接結合來激活MKK7和JNK。 研 究 發 現 存 在 一 個 MKK7－Gadd45β：Gadd45MKK7四聚體復合物，這個復合物的復合性可以通過MKK7分離而增加。Gadd45蛋白包含多個蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點。Gadd45蛋白的轉錄后調節如何改變其功能還不清楚，Gadd45蛋白和不同的家族成員可以組成單或異聚體；而他們調節Gadd45功能的作用機制還不清楚。

有推測說Gadd45和它的配體蛋白的相互作用受Gadd45及其配體蛋白的表達水平、細胞定位和翻譯后修飾所調節，還有可能由刺激的類型，大小及細胞種類所決定。

2 Gadd45作為應激反應基因調節腫瘤生長

應激反應基因在監視致癌刺激和調節腫瘤生長中的復雜作用還不完全清楚。在腫瘤形成中，研究最多的致癌應激反應因子是p53及其多個細胞功能。最近研究表明，無論體內還是體外，Gadd45蛋白均是重要的致癌應激反應因子。小鼠細胞需要導入兩種活化的癌基因才能產生癌變，破壞Gadd45基因后單個癌基因即可引起癌變。對Gadd45α缺陷小鼠中獲得的MEFs而言，H－ras完全能夠引起癌變。Gadd45β和Gadd45γ在易感性 MEFs中引起單癌基因變形的功能還在研究中。

研究發現Gadd45蛋白在體內腫瘤發育的調節中也起作用。對Gadd45α缺陷和Gadd45β缺陷小鼠觀察發現存在基因突變頻繁、電離輻射易感性和化學致癌作用易感性。這也證明腫瘤細胞的存活依賴于NF－κB調節的Gadd45α和Gadd45β抑制.

在不同腫瘤中的Gadd45家族成員頻繁突變還有待研究。通過啟動子甲基化來抑制Gadd45家族三個成員的表達已在多種人類腫瘤中觀察到。在大多數乳腺癌中，Gadd45α啟動子被甲基化，導致和正常乳腺上皮細胞相比Gadd45α表達減少［9］。在腦下垂體瘤中，67%的患者可以觀察到Gadd45γ基因表達沉默。這種下調和Gadd45γ基因甲基化相一致，而拮抗這種甲基化改變可以引起該蛋白的過表達。Gadd45γ還在甲狀腺癌和65%肝癌中表達下調，均是由于Gadd45γ啟動子的高甲基化。其他研究還發現，在肝癌中Gadd45家族三個基因都有甲基化和沉默，這說明Gadd45基因表達和肝癌生成間存在必然聯系［10］。此外，丙型肝炎病毒引起的Gadd45β表達下調導致細胞周期停滯。丙型肝炎病毒中的Gadd45β啟動子高甲基化和這種細胞周期變化有關，且和丙型肝炎病毒相關肝癌有聯系［11］。Ying等在75個細胞系中分析Gadd45γ啟動子兩個區域的甲基化狀態。他們發現在腫瘤細胞系中啟動子高甲基化出現頻繁，包括85%非霍奇金淋巴瘤、50%霍奇金淋巴瘤、73%鼻咽癌、50%頸部腫瘤、29%食道癌和40%肺癌，但在正常上皮細胞系、正常組織或外周血單核細胞中卻沒有這種甲基化。為了獲得Gadd45γ甲基化的更多信息，他們還進行了高分辨率亞硫酸氫鹽測序。最后發現在所有表達沉默的細胞系中均有高密度甲基化CpG位點，這表明Gadd45γ沉默可能和腫瘤的發病有關。在前列腺癌中也可以觀察到Gadd45α的甲基化調節。由于其在多西紫杉醇治療中表達上調，且可能和多西紫杉醇調節的前列腺癌細胞毒性有關，Gadd45α被認為是前列腺癌的潛在的治療靶點［12］。其他研究發現在多種腫瘤中激活 NF－κB可導致 Gadd45α和Gadd45γ抑制。因此，活化NF－κB和啟動子甲基化可能聯合作用抑制腫瘤中的Gadd45基因。

在胰腺癌中也發現異常Gadd45α表達。有研究表明Gadd45α在多個胰腺導管癌細胞中表達升高，而抑制Gadd45α表達可抑制其中一個胰腺導管癌細胞系的生長和存活［13］。另一個研究發現在PANC1胰腺癌細胞系中，Gadd45α異位表達導致細胞周期停滯和凋亡［14］。這兩個研究中，在胰腺腫瘤細胞生長和存活中Gadd45α的作用相矛盾。研究發現，54%人類胰腺導管癌中Gadd45α表達水平提高。而且，和Gadd45α表達水平未見異常的病人相比，Gadd45α蛋白的過表達和p53功能缺失協同，可引起預后不良。在可切除的侵襲性胰腺導管癌中，Gadd45α頻繁突變，這種突變和p53的狀態一樣，都影響著病人的預后。通過shRNA抑制內源性Gadd45α表達可以限制細胞數，這是由于細胞周期停滯和/或凋亡。因此，需要進一步研究以明確Gadd45α及其他家族成員在胰腺癌發生中的作用。

最近研究重點是Gadd45α作為致癌刺激反應因子在乳腺癌發生中的作用［15］。通過比較分析MMTV－Myc和 MMTV－Ras小鼠，發現 Gadd45α在乳腺癌發生中即是抑制因子，又可以是促進因子，這主要取決于針對不同致癌刺激的信號通路。Gadd45α腫瘤抑制功能主要通過活化JNK和p38刺激激酶來調節，這可以促進Ras誘導的凋亡和衰老，且只對Ras致癌刺激反應。相反，Gadd45α的腫瘤促進功能通過GSK3b/b連環蛋白級聯的MMP10表達負調節，可以導致腫瘤血管化增加，且只對癌基因Myc反應。這一新發現表明Gadd45α通過不同的信號通路，即可促進，又能抑制乳腺癌的生成，這主要取決于活化癌基因的分子結構。

3 Gadd45在白血病中的作用

在白血病細胞中，Gadd45的表達可以被不同的刺激誘導，這包括分化誘導因子和遺傳毒性因子。在骨髓分化起始時即可誘導Gadd45基因，這表明Gadd45蛋白在白血病中起重要作用。在Gadd45α或Gadd45β缺陷小鼠的外周血或骨髓中未發現明顯異常，然而在血液的刺激下，細胞因子的急性刺激、骨髓消融、炎癥和遺傳毒性刺激，Gadd45α和Gadd45β缺陷小鼠均表現出異常反應［16］。

Gadd45蛋白作為致癌刺激反應因子，在造血細胞發育中它的表達調節和對刺激的反應表明在白血病中它的表達改變起重要作用。Fms酪氨酸激酶（FLT3）的激活突變存在于AML的基因損傷中，表現在大約30－35%AML病例中［17］。最常見的突變是細胞內的內部銜接重復（ITD）。在一組AML樣本中通過檢測Gadd45αmRNA水平來研究其與FLT3－ITD 突 變 的 關 系［18］，在 FLT3－ITD＋ AML中 Gadd45αmRNA 水 平 明 顯 低 于 FLT3－ITDAML，這和AML中FLT3－ITD誘導的Gadd45α下調有關。此外，在原始AML樣本中Gadd45α表達的研究顯示與正常組相比Gadd45α明顯低表達。

提高Myc表達在許多白血病和實體腫瘤中均有表現。多個細胞外和細胞內信號級聯能夠調節Myc致癌基因。Myc的異常調節并不局限于Myc基因的異常，還可出現與調節分子控制myc基因表達引起的直接或間接突變。這說明Myc的異常調節和髓樣白血病中其他致癌基因，如AML1－ETO、PM－RARA以及PLZF－RAR的活化，FLT3受體酪氨酸激酶活化突變，以及BCR－ABL相關。在小鼠模型中，急性髓性白血病可以快速誘導myc，而不需要淋巴瘤相關抗細胞凋亡突變，而且Mcl1單劑量不足可以抑制小鼠myc誘導的急性髓性白血病［19，20］。研究發現，在 myc過表達的骨髓細胞中，Gadd45α的缺失可以減少凋亡，從而增加細胞增殖。這表明Gadd45α在調節白血病中發揮腫瘤抑制物的作用。

4 小結與展望

在很多實體腫瘤以及血液系統腫瘤中均觀察到Gadd45的表達異常。大量研究結果表明Gadd45蛋白即可促進又可抑制腫瘤的生成，這不僅與致癌基因的分子結構及細胞類型密切相關，而且還與參與作用的不同信號通路有關。進一步的研究旨在明確Gadd45蛋白如何與不同信號通路相作用，從而對不同的致癌刺激所產生促進或抑制腫瘤生長的作用。由此可見，Gadd45蛋白及其信號靶點可能會成為一個新的癌癥基因治療的分子靶點。

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