馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測技術比較與選擇

邱彩玲，呂文河，魏 琪，呂典秋，李學湛，白艷菊*

（1.黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；2.東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030）

馬鈴薯，其經濟價值在全世界的作物中占第四位。然而，諸多的病害卻威脅著馬鈴薯的生產，其中馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTVd）就是其中重要的一種。PSTVd自1922年發現以來，已經迅速地傳播到了許多國家，如加拿大、阿根廷、俄羅斯（前蘇聯）、波蘭、匈牙利和保加利亞等，后來又傳入中國，并已經造成了一定的經濟損失。

PSTVd具有高度的侵染性，是引起馬鈴薯品種退化和產量降低的主要病害之一。PSTVd強系可引起減產60%，弱系減產20%～35%，并且會使塊莖畸形，變小，降低馬鈴薯的產量和商品性，造成嚴重的經濟損失。由于該病害危害重，易傳播，因此，中國及很多國家和地區都將其列為檢疫性病害，足見此病害的嚴重性。PSTVd在中國分布廣泛，一些染病地區馬鈴薯減產幅度高達80%。

由于PSTVd能夠隨著馬鈴薯的無性繁殖傳遞給后代，而且目前還很難通過莖尖剝離或者超低溫處理等方法將其徹底脫除，因此，目前控制該病害的最主要方法是通過嚴格的檢驗檢疫，生產無毒種薯，從源頭上控制該病害的發生和傳播。因此，用于檢驗PSTVd的技術就成為了控制該病害的關鍵所在。

目前，全世界普遍采用的檢測PSTVd的方法有生物學方法（接種鑒定）、電子顯微鏡技術、往返－聚丙烯酰 胺 凝 膠 電 泳（Return－polyacrylamide gel electrophoresis,R－PAGE）、核酸斑點雜交（Nucleic acid spot hybridization,NASH）、逆轉錄－聚合酶鏈式反應（Reverse transcription－polymerase chain reaction, RT－PCR）和實時熒光定量 RT－PCR（Real－time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription－polymerase Chain Reaction,FQ RT－PCR）等，這些檢測方法都各有利弊，我們應首先了解這些方法的特點，然后根據自身條件等合理地選擇檢測方法，更好地控制馬鈴薯脫毒種薯和種苗的質量。

1 檢測技術

1.1 生物學方法

傳統的生物學鑒定方法是以植物病原在寄主上的表現癥狀作為識別病害和鑒定病原的基礎。該方法一般分為目測法和指示植物法兩種，前者主要利用病原在寄主上的癥狀來區別寄主是否受到感染，指示植物法則是利用一些模式植物上出現的特征來鑒別是否存在病原感染的方法。1964年，Raymer等[1]利用番茄作為PSTVd的指示植物進行PSTVd鑒定，該方法是利用生物學方法檢測PSTVd最基本、最早的方法。大體做法是在番茄長到兩片真葉時，在27～30℃，10 000 Lx光照下進行接種，接種后2～4周或更長時間，觀察植株表現，感染PSTVd的植株一般會出現矮化，頂部新生葉片變小，扭曲，粗縮，下卷，葉片淡綠色，逐漸發生中脈和支脈壞死等癥狀。利用該方法還可鑒定PSTVd株系致病性的強弱，目前仍然是研究PSTVd及其相關領域不可或缺的基本方法。但該方法具有諸多缺點，如鑒定周期長，受溫度、光照等環境條件影響大等，對于不同品種和環境有不同的表現，并且還存在潛伏侵染等情況，因此，此方法一般不適于日常檢測。

1.2 電子顯微鏡技術

20世紀70年代，Sogo等[2]就利用電子顯微鏡對PSTVd進行了檢測和觀察，從而確定了PSTVd的形態和大小等信息，為PSTVd的相關研究工作打下了堅實的基礎。該方法具有快速、簡單、直接等優點，但是，該方法需要一定的專業電鏡操作技能，且電子顯微鏡體積龐大，要求高，需要專門的實驗室安放，價格昂貴，一般的實驗室不具備該設備，因此，不適于大面積推廣用于日常PSTVd檢測。

1.3 往返電泳法

一些研究者利用R－PAGE成功檢測PSTVd[3,4]，該方法后來被廣泛應用于PSTVd的檢測。該方法克服了生物學方法需要周期長，受環境影響大的缺點，同時不需要像電子顯微鏡那樣的設備，在一段時間內得到了廣泛的應用。之后又對該方法進行了改進，使之可根據PSTVd電泳遷移率來鑒定PSTVd的致病性。目前，該方法仍在一定范圍內應用。然而，雖然該方法克服了以往檢測技術的諸多缺點，但該技術仍然存在一定的不足，如檢測靈敏度低，一次性檢測樣品量小等，不適于大量樣品的檢測。

1.4 核酸斑點雜交

隨著生物技術突飛猛進的發展，越來越多的生物技術可以被應用于PSTVd的檢測，國內外很多學者都開始應用NASH檢測PSTVd[5－7]。此法基于互補堿基的結合，因而可靠、靈敏度高。1989年以后，32P和生物素先后被應用于cDNA探針的標記[8,9]，但是，32P半衰期短，有放射性危害，對操作及廢物處理要求嚴格，而生物素成本較高，因此，這兩種方法都沒有廣泛普及。1992年，何小源和周廣和[10]用光敏生物素標記了PCR擴增后的PSTVd－cDNA探針。1997年，董江麗等[11]用長臂光敏生物素標記cDNA探針，克服了之前的一些弊端，使該技術更具實用性。2009年，邱彩玲等[12]利用地高辛標記的探針及其核酸斑點雜交檢測PSTVd試劑盒的成功研制為核酸斑點雜交法檢測PSTVd開拓了更為簡便的途徑。經過諸多學者的共同努力，現在利用NASH方法檢測PSTVd已經變得非常簡便，一次可以檢測大量樣品，靈敏度高，操作簡單，對環境友好，對操作人員沒有危害，是日常檢測PSTVd非常便利且有效的方法。

1.5 逆轉錄-聚合酶鏈式反應

RT－PCR是指在對類病毒RNA基因組進行擴增之前需要先用逆轉錄酶（Reverse transcriptase）在引物的引導下先合成與類病毒基因組互補的DNA（Complementary DNA,cDNA），然后進行PCR擴增的方法。該方法具有靈敏度高的優點，但是，非特異性擴增是RT－PCR方法原理上的缺陷，容易受到試劑、引物等的污染而出現假陽性，因此檢測結果往往不可靠，但是對于類病毒的基因組序列分析卻非常重要。

1.6 實時熒光定量RT-PCR

FQ RT－PCR是檢測低豐度RNA的敏感方法，該方法是在RT－PCR基礎上發展起來的一種靈敏度較高的核酸定量技術，該技術已經被成功的用于檢測植物病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒類病毒。這種方法檢測靈敏度高，且可以定量。然而，Real－time PCR儀及相關的試劑和耗材價格昂貴，檢測成本非常高，而且對于種薯和種苗質量檢測來講，并不需要知道其感染PSTVd的濃度，只需要知道感染與否即可，因此，此方法一般不用于日常檢測，僅適于有特殊要求或者非常重要的資源的檢測。

除上述幾種常見的檢測方法以外，還有基因芯片、寡核苷酸微點陣技術等，只是這些方法目前普及率比較低。

2 如何選擇合適的檢測技術

對于種薯和種苗生產者來說，為了生產合格的脫毒種薯和種苗，PSTVd是必須要檢測的一個重要參數。那么，面對眾多的檢測技術和方法，我們應該如何選擇符合自己需要的檢測技術呢？以下幾方面是要重點考慮的因素。

2.1 檢測目的及要求

檢測目的和要求是我們首先要考慮的問題，對于即將用于擴繁的種苗來講，此階段需要檢測的樣品數量少且尤為重要，因此，在條件允許的情況下，應盡可能選擇靈敏度較高的技術，以確保擴繁種苗的質量，避免后期造成無法挽回的損失。如果是已經擴繁到很多種苗或者進行田間大范圍檢測，適宜采用靈敏度較高且一次可以檢測大量樣品的方法，如NASH，這樣既可保證靈敏度，又可節約人力物力，提高工作效率，節約成本。

2.2 實驗設施及經費條件

在選擇檢測技術的時候，實驗條件和設施是必須考慮的因素之一，不同的檢測方法需要不同的設備，要全方位考慮問題，作出適當的選擇，在保證檢測質量的同時盡可能減少不必要的經費支出。

當然，上述參考意見僅考慮技術層面等相關的問題，并沒有涉及法律、法規等因素，因此，種薯和種苗生產者還應深入學習相關的法律法規，熟悉各種相關的標準和技術規程，在確保種薯、種苗質量的同時，合理地保護自己和他人的合法利益。

[1]Raymer W B,O’Brien M J,Merriam D.Tomato as a source of an indicator plant for the potato spindle tuber virus[J].Amer Potato J,1964,41:311－314.

[2] Sogo J M,Koller T,Diener T O.Potato spindle tuber viroid:X. Visualization and size determination by electron microscopy[J]. Virology,1973,55(1):70－80.

[3] Schumann G L,Thurston H D,Horst R K.Comparison of tomato bioassay and slab gel electrophoresis for detection of potato spindle tuber viroid in potato[J].Phytopathology,1978,68:1256－1259.

[4] Pfannenstiel M A,Slaok S A,Lane L C.Detection of potato spindle tuber viroid in field－grown potatoes by an improved electrophoretic assay[J].Phytopathology,1980(70):1015－1018.

[5] Barker J M,Mclnnes J L,Murphy P J,et al.Dot－blot procedure with(32P)DNA probes for the sensitive detection of avocado sunblotch and other viroids in plants[J].Virol Meth,1985,10: 87－98.

[6] Maule A J.The application of spot hybridization to the detection of DNA and RNA viruses in plant tissues[J].Virol Meth,1983,6: 215－224.

[7]呂典秋,李學湛,白艷菊,等.NASH技術和R－PAGE技術在馬鈴薯類病毒檢測上的應用[J].東北農業大學學報,2003,34(1): 15－18.

[8]曹先維,張鶴玲.用32P－cDNA探針核酸斑點雜交鑒定PSTV[C].中國馬鈴薯和甘薯合作研究進展,1986～1989.1989:71－78.

[9]張鶴齡,曹先維,Ilse Balbo,等.用生物素標記cDNA探針檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].病毒學報，1989,5(1):72－75.

[10]何小源,周廣和.應用聚合酶鏈式反應擴增和光敏生物素標記的cDNA探針檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].病毒學報，1992,8(4):337－341.

[11]董江麗,哈斯阿古拉,張彤,等.用長臂光敏生物素標記的cDNA探針核酸斑點雜交檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].內蒙古大學學報:自然科學版,1997,28(4):537－540.

[12]邱彩玲,劉尚武,王紹鵬,等.馬鈴薯類病毒的危害及NASH檢測試劑盒的研制[M]//.陳伊里,屈冬玉.馬鈴薯產業與糧食安全.哈爾濱:哈爾濱工程大學出版社,2009.