水稻E3泛素連接酶研究進展

戴陽朔，董 錚，李 魏，戴良英

(湖南農業大學生物安全科學技術學院，長沙410128;作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙410128)

泛素—蛋白酶體途徑(ubiquitin－proteasome pathway，UPP)廣泛存在于真核生物中，主要包括泛素化系統和26S蛋白酶體系統兩部分。該途徑在維持細胞功能，細胞周期運轉，胚胎發育，激素響應，抵御環境脅迫和衰老等方面發揮著重要的作用。在泛素化系統中，關鍵酶主要包括泛素活化酶(Ubiquitin－activating enzyme，E1)、泛素結合酶(Ubiquitin －conjugating enzyme，E2)和泛素連接酶(Ubiquitinprotein ligase，E3)。該系統對維持細胞內蛋白質的產生和降解的平衡及維持細胞的穩態和正常功能方面起著重要作用。該系統一個重要的特點就是E1s、E2s、E3s的數量存在很大的差異。在擬南芥中，約1 400個基因(占總蛋白質數量的5%左右)編碼泛素化系統的組分，其中E1基因只有2個;E2基因有37個，E2－like基因8個;E3基因超過1 400個［1］。在水稻中E1基因有6個，E2及 E2－like基因有49個，而E3基因則超過1 300個［2］。這可能主要是由于在泛素化系統中，E3的功能主要是特異性地識別不同的泛素化底物。近年來，擬南芥中E3在調控生長發育以及應對逆境脅迫等方面的研究取得較大進展，而E3在水稻中的研究盡管也取得了一定進展，但相對緩慢。本文在簡單概述泛素E3連接酶結構的基礎上，主要對近年來水稻中E3連接酶介導的生物學功能進行綜述。

1 E3泛素連接酶的結構特點與分類

E3泛素連接酶是一個超大的蛋白家族，其在整個泛素蛋白質降解途徑中決定底物特異性的部分。根據E3的結構組成，它可以分為單亞基E3和多亞基 E3 兩大類［3］。

單亞基的E3主要有兩類:一類含有HECT(homologous to the E6－AP carboxyl terminus)結構域，一類含有RING/U－box結構域［4］。HECT結構域長約350個氨基酸殘基，N端與E2結合，距C端約30個氨基酸殘基處有一個與泛素形成硫脂鍵的半胱氨酸位點［5］。含有HECT結構域的E3廣泛存在于植物中，但在水稻中目前還沒有對其功能研究的報道。單亞基RING型E3是一類含有RING－finger結構域的蛋白。RING finger結構域是指70個氨基酸中由半胱氨酸(C)和組氨酸(H)組成的8個氨基酸通過與鋅離子螯合作用形成C3H2C3(RINGH2)或 C3H1C4(RING － HC)構型［6］。U －box結構域則是通過靜電的作用形成一種與RING finger結構域類似的構型，使得其結構比RING finger結構域更保守和穩定［7］。兩者由于結構上相似，在泛素蛋白質降解途徑中起著類似的功能。

多亞基的E3主要有APC(Anaphase Promoting Complex)、SCF(Skp－Cullin－F－box)和 VBC(VCB－Cul2 complex)復合體，它們都含有一個支架蛋白Cullin(或Cullin－like)和一個RING－finger蛋白。在植物中研究得比較深入的主要是SCF復合體，例如 SCFTIR1、SCFCOI1、SCFEBF1/EBF2［8～10］等。SCF 復合體包含SKP1、Cullin和F－box三個蛋白，SCF與一個有RING－finger結構域的蛋白和一個小分子蛋白RUB1共同作用組成E3［11］。在SCF復合體中，Cullin作為支架蛋白結合RING－finger蛋白和連接蛋白SKP1，SKP1則結合一系列具有底物特異識別功能的F－box蛋白［12，13］。隨著越來越多的新型 E3被發現，理解其功能發揮的作用機制已成為當今研究的重要方向。

2 水稻中單亞基RING E3的生物學功能

在真核生物中，RING－finger蛋白是一個龐大的家族，大部分具有E3連接酶的活性。RING－finger蛋白被認為在介導泛素轉移特異性底物方面具有重要作用，參與各種翻譯后調節過程，如蛋白降解、蛋白功能和結構改變、蛋白定位變換等［6］。單亞基RING E3的RING －finger結構域負責結合E2，其他的結構域則負責結合靶標蛋白和一些其它的輔助因子。在植物中，如模式植物水稻和擬南芥中，已知的RING－finger蛋白分別至少有425和469個［14］。目前水稻中已經研究發現的E3以單亞基RING型居多，這些已發現的單亞基RING E3在水稻的抗病、抗非生物脅迫及生長發育等方面起重要的作用。

2.1 單亞基RING E3介導的水稻抗病反應

Xb3是水稻白葉枯病正調控因子Xa21的一個互作蛋白，其 N端含有8個重復的錨蛋白結構域［15］，C端含有1個 RING －finger基序，這兩個結構的功能分別是與Xa21激酶結構域結合和發揮E3泛素連接酶活性。Xa21蛋白不是通過Xb3的泛素化途徑降解，Xb3對于維持 Xa21蛋白穩定性和Xa21介導的抗病反應是必需的。當病原菌侵染的時候，Xb3與Xa21形成復合體通過磷酸化作用將Xb3激活，被激活的Xb3可能通過泛素化降解抗病反應中負調控因子，從而激活下游的抗病信號蛋白。

OsBBI1是一個表達受稻瘟病菌(Magnaporthe Oryzae)誘導的 RING－finger類型 E3泛素連接酶［16］。OsBBI1正調控稻瘟病抗性反應，OsBBI1過表達植株提高了對稻瘟病的抗性。在接種稻瘟病菌后，OsBBI1過表達植株的葉鞘表皮細胞壁厚度比對照大，細胞壁合成相關基因的表達量上升，說明OsBBI1可能通過改變細胞壁抗性反應在抗稻瘟病過程中起作用。

2.2 單亞基RING E3介導的水稻非生物脅迫反應

OsDSG1是一個從種子延遲萌發的T－DNA突變體群體中鑒定出來的RING－finger類型E3泛素連接酶［17］。與野生型相比較，除了延遲種子萌發外，osdsg1突變體對高鹽和干旱脅迫的耐受性增強。在osdsg1突變體中，一系列ABA信號途徑基因和ABA響應基因的轉錄水平顯著升高，說明OsDSG1可能是依賴于ABA信號途徑來負調控干旱和高鹽等逆境脅迫響應過程。

OsDIS1是從干旱處理的水稻芯片數據中分離出來的RING－finger類型E3泛素連接酶。相比對照，OsDIS1過表達削弱了水稻對干旱的抗性，而該基因的RNA干擾卻增強了水稻對干旱的抗性。在正常和干旱條件下，OsDIS1過表達植株中大量逆境脅迫應答基因和調節因子被誘導或抑制表達［18］。此外OsDIS1與OsNek6存在相互作用，且OsDIS1可在體外泛素化OsNek6［19］。說明OsDIS1可能通過在轉錄水平調控一系列逆境相關基因的表達，及翻譯后修飾OsNek6來負調控水稻的干旱脅迫響應過程。

水稻OsSDIR1是擬南芥ABA信號正調控因子SDIR1的同源蛋白，是一個RING－finger類型的E3泛素連接酶［20］。OsSDIR1能夠互補擬南芥sidr1突變體對干旱敏感的表型，且過表達OsSDIR1的擬南芥植株對ABA更加敏感。與對照相比，干旱處理下過表達OsSDIR1的水稻植株中氣孔關閉的比例增加，葉片失水速率減慢，表現出較強的干旱耐受性。說明OsSDIR1可能與SDIR1相似，通過介導ABA信號轉導途徑正調控水稻干旱脅迫響應過程。

Rma1H1是辣椒中一個RING－finger類型的泛素E3連接酶，通過泛素化修飾水通道蛋白PIP2;1，正調控植物干旱脅迫反應［21］。Bae等［22］采用同源克隆的方法分離出Rma1H1在水稻中的一個同源基因OsRDCP1，該基因也編碼一個RING－finger類型的泛素E3連接酶。與對照相比，OsRDCP1過表達植株在嚴重干旱的情況下表現出較強的干旱耐受性，說明OsRDCP1蛋白是一個水稻干旱脅迫響應過程正調控因子。

2.3 單亞基RING E3介導的水稻其他生物學過程

GW2是通過圖位克隆的方法得到的一個影響稻谷的粒寬和粒重的 QTL［23］。水稻品種 FAZ1中GW2蛋白含有425個氨基酸;而水稻品種WY3中GW2等位基因由于第4個外顯子上一個堿基的缺失，使其蛋白翻譯提前終止，編碼的產物只有115個氨基酸，缺失的部分為錨蛋白結合位點。這兩個等位基因都具有完整的RING－finger結構域和E3泛素連接酶活性。與FAZ1相比，WY3由于GW2功能缺失使其底物不能被特異識別，進而激活穎花外殼細胞的分裂，從而增加穎花外殼的寬度;另一方面，間接地提高了灌漿速率，胚乳的大小得到增加，最終使得粒寬和粒重增加，產量提高。這說明GW2通過負調控細胞的分裂控制水稻粒型及產量。

3 U－box類型E3介導的生物學過程

植物中廣泛存在 U－box基因，擬南芥中有64個U－box蛋白［24］，而水稻中有 77個 U－box蛋白［25］。U－box蛋白構象與RING－finger蛋白極其相似，兩者都能促進底物蛋白泛素化降解，在細胞內異常蛋白的降解及質量控制方面發揮著重要的作用。現有一些報道證明U－box蛋白也在水稻抗非生物脅迫和抗病過程中發揮作用。

OsUPS是一個受磷饑餓誘導的U－box蛋白，在缺無機磷的條件下，水稻植株OsUPS表達水平上調［26］。自身泛素化實驗表明，在細菌中表達的Os-UPS具有E3泛素連接酶活性，說明OsUPS可能通過泛素化反應調控磷信號轉導途徑。

Park等［27］鑒定了水稻細胞質內一個具有E3泛素連接酶活性的U－box蛋白OsPUB15。OsPUB15的T－DNA突變體表現出生長遲緩，幼苗致死，種子不能產生初生根，莖的發育也顯著延遲，這些異常的表型能被兩種抗氧化劑兒茶素和維生素C部分恢復。與對照相比，突變體中過氧化氫和氧化蛋白的含量更高。在過氧化氫、鹽、干旱脅迫下，OsPUB15表達水平明顯升高，在高鹽條件下OsPUB15超表達植株長勢比對照更好。說明PUB15可能通過減少活性氧脅迫正調控水稻逆境脅迫響應過程。

Zeng等［28］利用圖位克隆技術分離了一個調控水稻開花期和細胞程序性死亡的基因Spl11，其編碼的SPL11蛋白具有E3泛素連接酶活性，該活性依賴于完整的U－box結構域。spl11有一個單堿基替換，導致其編碼的SPL11蛋白過早終止，該基因突變后導致水稻開花期延遲和細胞程序死亡加速。VEGA－Sanchez等［29］采用酵母雙雜交篩選得到一個SPL11互作蛋白SPIN1，SPIN1是一個RNA/DNA結合蛋白。Spin1超表達轉基因植株表現出開花期延遲，是水稻開花期的一個負調控因子。泛素化實驗表明SPL11單泛素化SPIN1，這說明SPL11可能通過單泛素化作用抑制SPIN1來促進水稻開花。

4 水稻中SCF型E3介導的生物學過程

在擬南芥中，目前的研究發現很多SCF復合體涉及生長發育等過程中關鍵步驟的控制，如SCFTIR1介導的生長素反應、SCFEBF1/EBF2介導的乙烯反應、SCFCOI1介導的茉莉酸反應等［6～8］。

而在水稻中，研究比較深入的則只有SCFGID2介導的赤霉素反應。Sasaki［30］等通過對水稻GA不敏感矮化突變體的研究分離出蛋白GID1(GA－insensitive dwarf 1)以及和擬南芥SLY同源的F－box蛋白 GID2(GA－insensitivedwarf 2)。研究發現GID1是GA的信號受體，該蛋白通過GA與SLR1(Slender Rice 1)直接作用。GA誘導SLR1磷酸化，從而促進GID2與磷酸化的SLR1直接相互作用，進而使磷酸化的SLR1被SCFGID2復合體泛素化并通過26S 蛋白酶體降解［31］。

F－box蛋白是一類含有F－box結構域的蛋白家族成員，是SCF復合體的重要組分。其N端有一段含60個氨基酸的F－box保守序列，該F－box結構域負責結合ASK/SKP。F－box蛋白C端部分可以是很多不同類型的蛋白相互作用結構域，負責識別特異性底物和與底物相結合［32］。目前的研究發現，F－box蛋白在水稻生長發育過程起著重要的作用。

OsFbx352是一個表達受ABA誘導的F－box基因，其轉錄水平會在種子吸漲后增加，而該增加過程明顯受到葡萄糖的抑制［33］。OsFbx352超表達轉基因植株的種子萌發受葡萄糖的抑制程度比對照要低，而OsFbx352的RNAi轉基因植株則比對照要高。在有葡萄糖存在下，過表達OsFbx352植株中ABA合成基因的表達降低，ABA代謝途徑相關基因上調。說明OsFbx352對葡萄糖誘導下的抑制種子萌發起到調節作用，而這種調節作用是通過影響ABA代謝實現的。

Duan等［34］發現水稻中的一個 F－box基因DDF1通過調節細胞分裂和細胞伸展影響器官大小。該基因的突變體表現出營養生長和生殖發育異常，除了小穗外所有器官均變小。研究發現DDF1正向調節B類基因OsMADS4和OsMADS16，負向調節雌蕊特化基因DL，這說明DDF1是調控水稻營養生長和花器官特化的一個重要遺傳因子。

水稻LP基因編碼一個富含Kelch的F－box蛋白［35］。突變體lp表現出花枝梗變多，籽粒數增加。同時突變體較對照更抗倒伏，每株籽粒產量也相應增加。實時定量PCR分析表明，突變體中的Os-CKX2(一個編碼細胞分裂素氧化酶/去氧化酶的基因)表達水平出現下調。說明LP可能通過參與調控植物組織的細胞分裂素水平，從而調控水稻株型進而提高水稻籽粒產量。

MAIF1是水稻中一個表達受到ABA和非生物脅迫迅速誘導的F－box基因［36］。過量表達MAIF1降低了水稻對ABA的敏感性和對非生物脅迫的耐受性，促進根的生長。這些結果表明，MAIF1在調節水稻生長過程中參與了多個信號途徑。由于限制植株的生長是植物應對非生物脅迫的一種策略，說明MAIF1可能通過控制根系生長在應對非生物脅迫過程中發揮著負向調控作用。

5 研究展望

二十幾年前科學家從植物中發現了泛素蛋白酶體降解途徑［37］。近年來，科學家在水稻E3泛素連接酶的結構和功能研究方面取得了一定的進展，E3泛素連接酶參與水稻生長發育等方面的調控作用也漸漸清晰。但仍存在很多問題需要解決，例如，水稻中存在著大量的HECT型的E3，它們的功能是什么?水稻中現已發現許多RING型、U－Box型和SCF型E3連接酶，它們的底物蛋白是什么?它們是如何識別底物蛋白的?這些E3是如何被調控的?對這些問題的深入研究，將有助于進一步揭示泛素化途徑調控水稻生長發育的機制。

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