黑色素瘤相關抗原(MAGE)基因在肺癌中的表達及意義

李廣旭 宋平平 綜述 張百江 審校

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發病率高,預后差,與肺癌易發生血行轉移和淋巴結轉移有關[1].淋巴轉移和血行轉移是肺癌的主要轉移方式,淋巴結及血行轉移狀況對于肺癌的準確分期、治療及預后具有重要的意義[2].但因微轉移灶不易被常規的檢查和診斷方法發現,使肺癌分期不準確,甚至耽誤了患者的治療.因此,探尋更有優勢的微轉移檢測指標和方法極為重要.作為一種高度腫瘤特異性相關基因,黑色素瘤相關抗原基因被認為是目前最佳的微轉移檢測指標,本文將就其在肺癌微轉移中的研究進展做一綜述.

1 黑色素瘤相關抗原基因(melanoma associated antigens genes, MAGE)基因的發現及結構

MAGE基因是一種原癌基因,屬于腫瘤-睪丸抗原(cancer-testis antigen, CTA)家族,首先從黑色素瘤中發現,目前發現的MAGE基因家族成員超過60個,MAGE基因家族的最大共同特征是其氨基酸序列存在一個MAGE同源結構域(MAGE homology domain, MHD).MHD一般含165個-171個氨基酸殘基,根據其氨基酸排列進行的結構預測表明,它可能含有4個α螺旋和5個β片層結構,但是其真實結構及功能目前還不是很清楚.根據MAGE基因在染色體上具體位置的不同及其表達模式的不同,MAGE基因被分為兩大亞家族,分別為MAGE-I類抗原和MAGE-II類抗原,MAGE-I類抗原屬于癌睪丸抗原中的一個大家族,其又可分為MAGE-A、B和C三個亞家族,它們主要分布在生殖細胞和滋養細胞;MAGE-II類抗原包括MAGE-D、神經細胞生長抑制因子抗原、網狀內皮系統刺激素抗原等,主要表達于神經組織和其它正常組織.在MAGE-I類抗原中MAGE-A具有嚴格的腫瘤特異性表達模式,可編碼腫瘤特異性抗原多肽,其編碼的蛋白產物能被細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CD8+)識別并誘導免疫應答,常被作為腫瘤診斷和免疫治療的重要靶分子,因此成為腫瘤免疫治療研究的熱點.

2 MAGE基因的調控及表達

2.1 MAGE基因的調控機制 MAGE基因在除了睪丸和胎盤組織之外的正常組織中幾乎不表達,但在腫瘤組織中卻存在高表達現象,目前在肺癌、肝癌、腎癌、黑色素瘤等腫瘤中均檢測到MAGE基因的表達.因其腫瘤特異性,對其研究逐漸受到重視.

目前認為MAGE基因表達調控機制主要有兩種:①MAGE基因是一種正常基因,甲基化控制其表達,基因調控方式中便包括DNA甲基化這一項.通常MAGE基因在人類正常體細胞中高度甲基化,而在某些惡性腫瘤細胞和胚胎細胞中表現為去甲基化.因為被DNA甲基化所調控的CpG島(CpG island)或富含CpG的區域控制著大部分的腫瘤睪丸抗原基因啟動子機MAGE-A基因,所以抑制轉錄主要是通過防止轉錄因子的結合和增加甲基化-CpG結合區域蛋白(methylation-CpG binding region of proteins, MBDs)來實現[3].②MAGE-A基因的表達調控與組蛋白的乙酰基化作用有關.組蛋白乙酰化可以從以下兩方面促進基因轉錄:轉錄活化因子能識別氨基末端乙酰化的核心組蛋白,松弛染色質,暴露核小體DNA,利于轉錄因子與之結合;組蛋白乙酰化可干擾組蛋白氨基末端與抑制因子之間的相互作用.Wischnewski等[4]通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、Western雜交、免疫細胞化學染色和瞬時轉染分析等方法,證實了啟動子的去甲基化和組蛋白乙酰化這兩種方法均可調控人腫瘤細胞MAGE-A基因的表達.Yanagawa等[5]應用RT-PCR技術對比分析了非小細胞肺癌患者的癌組織及非癌組織中MAGE-A1和MAGE-A3啟動子去甲基化和其表達的關系,結果在90%表達MAGE-A1的癌組織樣本中檢測到MAGE-A1啟動子的去甲基化,在92.3%表達MAGE-A3的癌組織樣本中檢測到MAGE-A3啟動子的去甲基化,統計分析顯示MAGE基因啟動子去甲基化與MAGE基因表達之間差異有統計學意義,MAGE基因啟動子去甲基化是誘發MAGE基因的表達首要原因.

2.2 MAGE基因在肺癌的表達 基于MAGE基因腫瘤表達特異性及抗原特異性,近年來MAGE基因與肺癌的相關研究逐步受到重視.Shin等[6]提取133例患者肺組織及痰液中的RNA,應用RT-PCR技術行MAGE基因檢測,發現MAGE A1-A6在肺癌組織中的陽性率為87.5%,在肺癌患者的痰液中的陽性率為50.8%;40例MAGE基因陽性的病例中,33例被診斷患有肺癌,7例為肺良性疾病,但這7例中6例出現了MAGE基因高度甲基化保護,因此可以說明MAGE的陽性表達提示著肺癌細胞或癌前細胞的存在.Karimi等[7]采用RT-PCR方法檢測MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3/6、MAGE-A4、MAGE-A12基因在肺癌中的表達,結果在58個腫瘤樣本中,至少有1種MAGE基因表達的樣本數為37個,其中MAGE-A4的表達率最高.Kim等[8]應用RT-PCR方法檢測MAGE A1-6基因在53例疑似肺癌患者組織樣本中的表達,結果MAGE基因在肺癌中的敏感性、特異性、準確性、陽性和陰性預測值分別為83%、58%、77%、87%和55%.這證明MAGE基因與肺癌具有高度密切性.Yanagawa等[5]應用RT-PCR技術對67例非小細胞肺癌患者的癌組織及非癌組織進行MAGE-A1和MAGE-A3的表達檢測,結果在全部非癌組織中均未查到MAGE-A1和MAGE-A3的表達,在肺癌組織中MAGE-A1的表達率為29.9%,MAGE-A3的表達率為38.8%,MAGE-A1和MAGE-A3在鱗癌中的表達高于腺癌,隨著病情進展,其表達率成逐漸升高趨勢.MAGE-A1和MAGE-A3表達組患者的預后差于不表達組患者.國內相關研究也已開展,韓秀晶等[9]應用間接酶免疫組化技術檢測MAGE-A3在45例非小細胞肺癌組織中的表達情況,結果顯示MAGE-A3在非小細胞肺癌中的敏感度為62.2%,與Yanagawa的觀點不同,其檢測出MAGE-A3在腺癌中的表達率高于鱗癌,與性別、年齡、淋巴結轉移無關.MAGE基因在肺癌組織中的表達這方面,國內外學者已達到共識,但關于癌型及臨床分期與MAGE基因表達的聯系存在不同的觀點,Shin等[10]應用PCR法檢測75例肺癌患者組織中MAGE A1-A6基因的表達,發現MAGE基因的表達與肺癌組織類型和臨床分期無相關性,僅與腫瘤大小有關,在<3 cm的腫瘤中其檢出率為74%,>3 cm的腫瘤中檢出率為58.7%.綜上所述,MAGE基因在肺癌中的表達有以下規律:①MAGE基因在肺癌中的表達具有高度特異性;②MAGE基因表達與肺癌的病理分期有關,分期越晚,表達率越高;③MAGE基因表達與肺癌病理類型有關,在鱗癌中表達率高于肺癌.在檢測時,各研究結果存在差異性,究其原因主要與檢測技術、操作水平、指標選擇等有關,鑒于MAGE基因在肺癌中的表達規律,MAGE基因表達檢測可用于早期肺癌的篩選、診斷、分期評估及臨床治療.

影響肺癌預后的主要原因是血行轉移和淋巴結轉移,早期發現肺癌微轉移將為早期診斷、指導臨床治療、檢測療效、判斷腫瘤預后提供參考依據,但目前一般使用的檢測標記物敏感性較低,迫切需要靈敏度高、特異性強的腫瘤標記物用于肺癌微轉移檢測.MAGE基因作為一種敏感度較高、特異性較強的標記物,越來越受到重視.劉濤等[11]采用RT-PCR 技術,通過檢測非小細胞肺癌患者外周血中的MAGE-1表達,研究非小細胞肺癌外周血微轉移與臨床特征之間的關系,結果顯示MAGE-1基因在非小細胞肺癌患者外周血中陽性表達率為57.15%,遠高于對照組中其陽性表達率(0/31);外周血MAGE-1的表達與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移關系密切.宋鑒清等[12]用甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測49例非小細胞肺癌患者外周血MAGE-A1、MAGE-A3基因啟動子區CpG島去甲基化的狀態,分析與臨床參數的關系,并進行24個月隨訪,結果肺癌患者外周血MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區CpG島啟動子呈去甲基化狀態分別為53.1%和49%;對照組外周血標本均呈現甲基化(100%),通過隨訪發現肺癌組MAGE-A1、MAGE-A3啟動子區CpG島啟動子呈去甲基化模式患者較呈甲基化患者預后不良,這說明MAGE-A1、MAGE-A3啟動子區CpG島啟動子去甲基化模式與肺癌的轉移、TNM分期及預后相關,通過對外周血相關基因的檢測,可為腫瘤早期診斷、療效觀察及預后判斷提供有價值的信息.在非小細胞肺癌淋巴結微轉移檢測方面,Dango等[13]將取自32例非小細胞肺癌患者術后的100枚淋巴結每枚平均分為兩部分,分別進行常規病理檢查及MAGE-A基因表達檢測,常規病理檢查陽性的淋巴結其MAGE-A基因表達率為66.7%,常規病理檢查結果陰性的淋巴結MAGE-A基因表達陽性率為9.6%,共37.5%的肺癌患者淋巴結檢測出MAGE-A基因表達,MAGE-A基因在淋巴結中的表達與腫瘤病理類型、病理分級、性別、年齡無關.Cucuruz等[14]運用LightCycler480儀器對89例肺癌患者的202枚淋巴結進行實時定量表達分析,結果提示MAGE-A1-6在支氣管內超聲引導下細針穿刺(endobronchial ultrasound-guided fi neneedle aspiration, EBUS-TBNA)取得的樣本中其表達率為28.7%,而在縱隔鏡取得的樣本中其表達率為20.0%;MAGE-A12在兩種方式取得的樣本中的表達率分別為8.2%和11.3%,經術后病理驗證,術前檢測到MAGE基因表達的患者,術后均診斷為廣泛的區域淋巴結轉移,術前EBUS-TBNA和縱隔鏡結合MAGE定量聚合酶鏈反應,可將病理組織學診斷的準確性提高至81.2%和86.4%.冼磊等[15]采用RT-PCR方法檢測53例非小細胞肺癌患者的111組淋巴結中MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4 mRNA的表達,其陽性表達率為41.4%,遠高于常規病理檢查結果的27.9%,常規病理檢查結果陰性淋巴結中至少有1種MAGE基因表達的概率為23.8%,在常規病理檢查結果陽性的淋巴結中其概率為87.1%,而在肺部良性疾病患者淋巴結中4種MAGE基因的表達均為0.相比于其它檢測指標,MAGE基因具有高度特異性及敏感性,能更早地檢測到非小細胞肺癌患者淋巴結、外周血中存在的微轉移,不僅能更早地診斷腫瘤,還能更準確地估計腫瘤臨床分期,為制定準確的治療計劃提供分子領域的支持.

2.3 MAGE基因在其它惡性腫瘤中的表達 MAGE基因不僅在肺癌中表達,在黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、精原細胞瘤、頭頸部鱗癌、食管癌、白血病、淋巴瘤和肉瘤等惡性腫瘤中均可檢測到MAGE基因的表達.

Curioni-Fontecedro等[16]發現MAGE-C1在原發性黑色素瘤和和色素瘤細胞株中的陽性表達率同為24%,MAGE-C2在原發性黑色素瘤和和色素瘤細胞株中的陽性表達率分別為33%和14%,在遠處轉移瘤中MAGE-C1及MAGE-C2的陽性表達率均為40%,同時發現MAGE-C1或MAGE-C2陽性的原發黑色素瘤患者淋巴結轉移率較高.Badovinac ?rnjevi?等[17]發現乳腺癌患者腫瘤切片中MAGE-A10的陽性表達率為64%,其表達與腫瘤的大小、分級及淋巴結狀態無關.Zhang等[18]運用實時-定量-聚合酶鏈反應發現肝癌患者外周血標本中MAGR-A1的陽性率為34.9%,AMGE-A3的陽性表達率為60.5%;在非肝癌患者血標本中并未檢測到MAGE基因的陽性表達.Dyrskj?t等[19]對350例長期隨訪膀胱腫瘤患者的腫瘤標本行MAGE基因檢測,結果顯示43%的腫瘤表達MAGE-A3基因,56%的腫瘤至少表達1種CT基因,同時MAGE-A3基因的表達有預后的預測價值.

3 MAGE基因影響腫瘤生長的分子機制

雖然MAGE基因已經發現20余年,其生物學特性仍未清楚,但一些證據表明MAGE基因的表達與腫瘤的發生、發展及預后有密切的關系,可用于腫瘤的診斷和免疫治療.首先,MAGE基因與腫瘤的發生有密切關系,主要是通過影響人體抑癌基因(p53基因)的活性來影響腫瘤發生.Yang等[20]研究發現MAGE-A、MAGE-B和MAGE-C等蛋白可能通過與p53基因結合,抑制其活性,促進腫瘤細胞的活化,促進惡性腫瘤的發生和發展.另有研究[21]顯示MAGE-A可以與p53核心區的DNA結構域結合,阻斷p53與啟動子的結合,達到延長細胞周期,降低細胞死亡的作用,這項研究證明MAGE-A蛋白可以通過抑制p53的轉錄而引起腫瘤的發生發展.國內也可見類似報道,桑梅香等[22]發現轉染p53基因可以使p21 WAF1啟動子介導的熒光素酶表達增加,而共同轉染恒定量的p53基因和不同量的MAGE-A4基因后p21 WAF1啟動子介導的熒光素酶表達明顯高于單獨轉染p53基因時的表達量;共同轉染MAGE-A4基因和p53基因后p21 WAF1 mRNA和蛋白表達水平均明顯高于單獨轉染p53基因時的表達水平;克隆形成實驗及原位末端轉移酶標記技術染色結果顯示,共轉染MAGE-A4基因和p53基因以后H1299細胞克隆形成數與單獨轉染p53基因組相比減少,而凋亡細胞數與單獨轉染p53基因組比較增加;最終結論證明MAGE-A4可以通過增強抑癌基因p53的轉錄活性,從而抑制腫瘤細胞的增殖并誘導腫瘤細胞凋亡.此外,MAGE-A3被發現是成纖維細胞生長因子受體2(f i broblast growth factor receptor 2,FGRF2)信號通路的靶基因,可負調節FGFR2的表達,并通過調節纖維連接蛋白而控制腫瘤的侵襲和轉移[23].MAGE基因還可通過細胞免疫達到殺滅腫瘤細胞的作用,在MAGE-A蛋白分子內至少有5個組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)I類分子限制性表位和6個MHC II類分子限制性表位,經由相應的MHC I類或II類分子遞呈給輔助性T細胞(helper T cells, CD4+)和CD8+細胞,使人體產生針對相應腫瘤的細胞免疫.Hama?等[24]研究發現,MAGE-A3抗肺癌機制為MAGE-A3抗原特定性CD4+細胞在白細胞介素17的影響下轉化為效應T淋巴細胞,分泌干擾素,攻擊并殺傷腫瘤細胞,達到抑制肺癌生長的作用.Baba等[25]研究發現MAGE-A抗原治療肺癌的主要機制為其抗原首先作用于MHC基因簇,后控制人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)I類分子,將信息呈遞給CD4+或CD8+細胞,產生干擾素或轉變為效應T細胞,達到消滅腫瘤的作用.MAGE-A4表達陽性患者中HLA I類分子缺乏患者的5年生存率明顯低于HLA I類分子健全患者.Peikert等[26]研究發現MAGE-A4穩定表達的細胞其凋亡指數和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的活性均比MAGE-A4表達陰性的細胞高,在用MAGE-A4反義RNA干擾MAGE-A4表達后,細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的活性明顯降低,結果提示MAGE-A4基因參與細胞凋亡信號轉導通路,可促進腫瘤細胞的凋亡,可能在腫瘤的發生中起到積極的防御作用,承載著治療腫瘤的新希望.

4 MAGE基因編碼蛋白的抗腫瘤治療

以MAGE基因為靶點的抗癌作用主要通過以下3種方法:①接種MAGE表位抗原疫苗;②阻斷MAGE基因與其配體的結合;③破壞操縱MAGE基因表達的監管系統.前兩種方法可極大限度的限制MAGE蛋白在正常組織的表達,同時對機體影響較小、副作用較少,大多研究都著重于前兩種方法.MAGE基因編碼的相關抗原在正常組織不表達(睪丸和胎盤除外),而睪丸和胎盤是免疫豁免器官,因此MAGE相關抗原是腫瘤特異性免疫治療的理想靶分子.

4.1 MAGE基因在惡性腫瘤免疫治療的應用 MAGE基因抗腫瘤治療要追溯到1999年,Marchand等[27]將多肽

MAGE-A1和MAGE-A3為黑色素瘤患者皮下注射,接受治療的25例患者中,7例腫瘤縮小,3例完全消失,2例的無瘤期達2年以上.經過不斷探索研究,Glynn等[28]發現腫瘤細胞中只要表達MAGE基因,便可抵抗腫瘤壞死因子介導的細胞毒性作用,從而達到抑制腫瘤細胞凋亡的作用.之后,Ueda等[29]將MAGE-A1、MAGE-A3抗原肽用于食管原發性黑色素瘤患者的治療,發現患者外周血中

IFN-γ明顯增多,患者的生存期較其它治療方式有所提高.

4.2 MAGE基因在肺癌免疫治療的應用 MAGE基因家族在肺癌中的廣泛表達為抗腫瘤作用提供了潛在的靶點,目前相應的抗原性疫苗已經問世.國外有1例病例報道[30],1

位肺腺癌患者首次手術后復發,二次手術后再次復發,后接受MAGE-A3相關抗原免疫治療,隨訪觀察18個月未見復發跡象.國外一項隨機II期臨床研究[31]將182例術后MAGE-A3表達陽性的肺癌患者(122例Ib期和60例II

期)隨機分為兩組,分別接受MAGE-A3疫苗和安慰劑治療,中位隨訪時間為28個月,共發現67例復發病例和45

例死亡病例,MAGE-A3疫苗組患者的無病間隔期、無病生存期及總生存率均優于對照組.另外開展的一項III期臨床研究[32],預計全球招募2,270例術后患者(Ib期-IIIa

期),其主要目的是觀察免疫治療對肺癌術后復發的預防作用,此外還要觀察免疫療法的療效,該研究在我國也招募患者,本項研究是目前世界最大的肺癌輔助治療臨床研究項目.

5 問題與展望

MAGE基因是較為敏感的腫瘤特異性基因,在肺癌腫瘤組織中高表達,而在非瘤性組織中罕有表達,在血液及正常淋巴結中無表達,在肺癌患者的外周血及轉移淋巴結中高表達,其免疫產品具有特異性高、副作用小的特點,有望成為肺癌免疫治療的靶點.加之肺癌是惡性腫瘤中發病率和病死率較高的腫瘤,MAGE基因與肺癌的關系已成為目前研究的熱點,可在非小細胞肺癌的早期診斷、微轉移灶檢測、復發監測、免疫治療及評估預后等工作中發揮作用.隨著對MAGE基因家族在肺癌領域研究的不斷深入,未來在肺癌的早期診斷、病理分級、臨床分期、免疫治療、評估預后等方面,MAGE基因家族將發揮更大的作用.