補腎活血對人臍靜脈內皮原代細胞NO表達的影響1）

劉中勇，李 林，方 家，陳寧南，鄧 鵬，方險峰，鄒國輝

中醫學認為婦女在絕經后機體開始向老年過渡。此時腎氣漸衰、天癸漸竭，女子以血為用，因數脫于血，且精血同源，故絕經后相關疾病以腎陰虛者多見[1，2]。在更年期綜合征中醫研究中，本病大多被認為屬腎陰虧虛[3，4]。中醫證型與性激素相關性研究也表明，促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成素（LH）升高，雌二醇（E2）下降，血清中NO水平明顯降低均為腎陰虛型[5，6]。腎為先天之本，通過其“藏精化血”，“主骨生髓、髓生血”的功能直接參與氣血活動，由于腎與血在生理上關系密切，因此，在病理上近代有關“腎虛血瘀”的論述頗多，認為腎虛必兼血瘀。“腎虛血瘀”也是婦女發生絕經后冠心病（coronary heart disease，CHD）的主要病機[7，8]。應用原代培養的人臍靜脈內皮細胞作為載體，加入eNOS抑制劑L－NAME處理細胞，制備NO低表達細胞模型，觀察補腎活血方劑對原代細胞NO分泌的提高作用。

1 材料與方法

1.1 材料 標本采自江西中醫藥大學婦產科正常分娩的新生兒臍帶。健康孕婦剖宮產后，無菌條件下剪取臍帶20cm，浸泡在磷酸鹽緩沖液中。立即對臍靜脈內皮細胞（HUVEC）進行分離培養。

1.2 儀器及試劑 DMEM培養基GIBCO公司，0.25%胰酶（廣州杏海生物，Ginbio），Ⅷ抗體（武漢博士德），I型膠原酶（sigma公司），FITC標記熒光二抗（武漢博士德），胎牛血清（杭州四季青），青鏈霉素雙抗（廣州杏海生物，Ginbio），NO檢測試劑盒（上海碧云天），倒置顯微鏡（NIKO），熒光顯微鏡 （Leica），超凈工作臺（江蘇蘇凈），酶標儀（BIOTEK）。

1.3 樣品采集 取剖宮產新生兒臍帶，注入NaCl至靜脈另一端流出液體透明為止。把37℃預熱的0.1%Ⅰ型膠原酶注入臍靜脈至下端溶液流出，用止血鉗夾閉下端靜脈，繼續向靜脈內注入膠原酶，用另一個止血鉗夾閉靜脈上端，將臍帶放入37℃CO2孵育箱中消15min。消化完畢后，松開臍帶兩端止血鉗，收集靜脈沖洗液，1 000r／min離心5min，棄上清。細胞重懸于RMPI1640培養液中，13%胎牛血清，置37℃，5%CO2孵育箱中培養。隔2d～4d更換1次培養基直至長成單層細胞。原代細胞生長融合至80%以上，用0.25%胰酶消化2min，1∶2傳代。

1.4 細胞因子Ⅷ免疫熒光染色 以每孔2×104／mL細胞密度接種24孔培養板做細胞爬片，培養24h，PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15min，－20℃預冷甲醇通透10min，5%羊血清室溫封閉1h，加小鼠抗人Ⅷ單抗（空白對照用PBS替代），4℃過夜。PBS洗3×5min，生物素山羊抗小鼠二抗室溫反應30 min，PBS洗3×5min。DAPI染色5min，熒光顯微鏡觀察。

1.5 藥物處理 補腎活血方：熟地黃20g，山萸12g，山藥12 g，澤瀉9g，丹皮9g，茯苓9g，丹參15g，水蛭3g。煎煮過濾除菌，低溫保存備用。

1.6 含藥血清制備 選用日本純種大白兔二只，其中一只分別每日分2次給予補腎活血方總量15g／kg；另一對照組每日給予等量溫開水（15mL），灌胃10d后，于取血前12h、6h、3h、1h再各灌胃1次，并于取血前24h禁食（不禁水），心臟采血，取血后無菌分離血清，經56℃、30min滅活處理后，用0.45μm的微孔濾膜過濾除菌，置－20℃冰箱保存備用。

1.7 濃度血清制備 對照組：將15mL正常兔血清、5mL新生牛血清加入80mLRPMI1640液至100mL；不同濃度含藥血清（即20%、10%、5%）：將20mL、10mL、5mL含丹地劑血清分別加入至每瓶有5mL新生牛血清、75mLRPMI1640液中，后兩組分別再補充正常兔血清15mL、20mL，使三組總量分別至100mL。

E2組：將17β－雌二醇用 RPMI1640液配成0.01μmol／L。空白組為不含兔血清，單純為培養液。

取對數生長細胞鋪種六孔板，每孔5×105細胞，每組3復孔。加eNOS抑制劑L－NAME按照10－6mol／L加入除空白組外所有組，預孵育1h加入不同劑量含藥血清繼續培養至24h收集上清液檢測NO含量，提取蛋白質做Western blot檢測。

1.8 細胞上清液中NO濃度測定 取出Griess ReagentⅠ和Ⅱ，使恢復室溫 ，取細胞上清液或者標準品50μL加試劑Ⅰ和試劑Ⅱ各50μL。酶標儀540nm檢測吸光度，利用標準曲線計算樣品濃度。

1.9 Western blot檢測蛋白eNOS蛋白表達 0.01mol／LPBS洗滌細胞兩次，每孔加入100μL RIPA裂解液，置冰上裂解20 min后，用干凈的細胞刮刷將細胞刮于孔的一側，然后用移液器將細胞碎片和裂解液移至1.5mL離心管中，4℃，12 000r／min離心5min，取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測。剩余樣品按比例加入5Xloading buffer，煮沸10min，分裝后－20℃保存。每個樣品取30μg置于10%SDS－PAGE凝膠上電泳分離，轉移至PVDF膜上。室溫下用5% 脫脂奶粉封閉1h。eNOS抗體以封閉液按照1∶500的比例稀釋，與PVDF膜一起封閉在雜交袋中4℃過夜后，與1∶6 000稀釋的羊抗兔IgG，室溫孵育1h。用SuperECL Plus超敏發光液按試劑說明要求顯影、曝光。用Quantity one分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數字化。目的蛋白的灰度值除以內參GAPDH（1∶1 000）的灰度值以校正誤差，所得結果即為樣品中eNOS蛋白相對表達量。

1.10 統計學處理 運用SPSS 15.0軟件包分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示。

2 結 果

2.1 細胞分離 用1%I型膠原酶消化20cm長臍帶所收獲的內皮細胞，接種于6cm培養皿，密度為105／mL～106／mL。接種4h后細胞開始貼壁，12h后大部分貼壁，24h后即可第一次換液除去未貼壁的紅細胞。早期的內皮細胞多呈小多角形、球形、短梭形，細胞單層生長，互不重疊。當原代細胞接種密度達到105／mL～106／mL時，在接種48h～72h生長最旺盛，4d～5 d即可融合。融合后的HUVEC為扁平多角形，呈典型的鵝卵石或鋪路石樣排列。細胞胞核清晰，細胞核為圓形或橢圓形，核內染色質稀疏空亮，核仁1～2個。免疫熒光顯示，細胞與FITC標記的Ⅷ蛋白結合，在熒光顯微鏡下呈綠色熒光，表明細胞表達Ⅷ蛋白，DAPI染色細胞核呈藍色。

2.2 細胞上清液中NO濃度 eNOS抑制劑與藥物處理細胞24h后。NC組（只加L－NAME）與空白組比較，NO含量明顯減少（5.64μmol／L±0.12μmol／L，P＜0.05）。陽性對照藥物雌二醇處理組明顯升高NO含量（13.52μmol／L±0.19μmol／L）。藥物處理組提高內皮細胞被L－NAME抑制的NO分泌。20%、10%、5%含藥血清處理 NO含量分別為（11.51μmol／L±0.68μmol／L，P＜0.05），（10.45μmol／L±0.36μmol／L，P＜0.05），（7.50μmol／L±0.45μmol／L，P＞0.05）。

3 討 論

正常的內皮功能對于血管壁具有重要的保護作用，血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化及許多疾病的始動環節[9]。內皮細胞損傷后發生的功能改變則是導致心血管疾病（如高血壓、心衰、冠心病、術后再狹窄、原發性肺動脈高壓等）發生發展的重要因素，同時也參與腎病、糖尿病等一些難治性疾病[10]。血管內皮細胞分泌的NO不僅可以調節血管平滑肌張力，也能抑制血小板聚集、白細胞黏附以及平滑肌細胞增殖，還可以減輕氧自由基造成的血管內皮功能障礙[11]，被認為是一種“內源性的抗動脈粥樣硬化分子”[12]。NO是由NOS催化L－精氨酸轉化而來，NOS是其生物合成的關鍵限速酶。NO生成減少是血管內皮功能不全的一個重要特征[13]。以血管內皮細胞功能障礙為共同特點的糖尿病、腦梗死、冠心病及高血壓等疾病患者，其血清NO水平明顯降低[14]。大量實驗證明，雌激素作用于內皮細胞后，一氧化氮合酶（eNOS）的數量上調[15]。雌激素的心血管保護作用與一氧化氮有關。成功分離培養人臍靜脈內皮細胞，觀察補腎活血方的研究表明，補腎活血方對更年期綜合征具有良好效果，對絕經女性血脂構成有正性作用。

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