AKT信號通路與干細胞增殖

王碧涵，楊萬章

1 絲氨酸／蘇氨酸激酶（AKT）信號通路概述

PI3－K／AKT信號通路最早被發現在胰島素刺激及其應答的調控中起重要作用。隨著研究的深入和下游底物的不斷發現，PI3－K／AKT信號通路作為一條非常重要的細胞內信號轉導通路被人們所認識。激素、生長因子、細胞因子、細胞外基質成分和應激等多種因素刺激后，AKT信號通路被活化，在細胞周期調控、細胞生長與存活，細胞增殖與凋亡，細胞的遷移、分化及糖類代謝等的調控中扮演重要角色。AKT執行的復雜功能，主要是通過磷酸化一系列特異性下游底物完成的。近年來對AKT信號通路的研究發現，干細胞的增殖影響AKT及其下游信號分子的磷酸化表達水平，這提示AKT信號系統在調控干細胞的增殖中起著重要的作用。

1.1 AKT的結構 AKT屬于AGC蛋白激酶家族[1]，已經被證實是PI3－K／AKT信號通路的中心介導蛋白7年，Staal等[2]在小鼠的反轉錄病毒AKT8中找到一個癌基因，命名為v－AKT7年，3個獨立的研究小組[3－5]先后成功克 隆出AKT基因，發現它是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，并認為AKT可能在酪氨酸和絲氨酸／蘇氨酸磷酸化途徑中形成功能聯系。AKT作為一種相對分子質量約60×103（60KD）的胞內信號蛋白，因其激酶結構域與蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）具有高度同源性，故又被稱為蛋白激酶B（PKB）。目前，在哺乳動物中已發現的AKT家族至少包括三種亞型：AKT1，AKT2和AKT3，也被稱為PKBα，PKBβ和PKBγ。AKT1在真核細胞中廣泛表達，主要調控細胞存活和增殖；AKT2在胰島素敏感組織中高度表達（如肌肉、脂肪組織），參與胰島素調節的代謝過程；而AKT3則主要分布在腦和睪丸組織，調節細胞的大小以及數目[6]。它們在結構上具有高度的同源性和保守性，其分子由氨基末端PH結構域、羧基末端調節結構域（包含疏水基）和中間的激酶催化結構域組成，含有thr308、thr450、Ser473和Ser124四個磷酸化調節位點，其中thr308（位于催化結構域）和Ser473（位于調節結構域的疏水基）的磷酸化與AKT活化有關，并且雙位點磷酸化才能使AKT完全激活。

1.2 AKT信號通路的調節 AKT是PI3－K／AKT信號通路中的關鍵信號轉導分子，其活化依賴于PI3－K，因此研究中多以磷酸化的 AKT（p－AKT）作為衡量 PI3－K 活性的指標。PI3－K（phosphoinositide 3－kinase，磷脂酰肌3－激酶），是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，根據結構和底物的不同可以分為三型，其中Ⅰ型P13－K參與生長因子和細胞因子激活的信號通路應答，主要介導細胞的生存、增殖、分化等生物學功能[7]。Ⅰ型PI3－K是一種包含催化亞基和調節亞基的異源二聚體，其中調節亞基由三個基因編碼，有五種亞型：p85α，p55α，p50α，p85β和 p55γ；催化亞基有三種亞型，p110α，p110β和p110δ，分別由不同基因編碼。胰島素或者生長因子等配體激活受體酪氨酸激酶（RTKs），或者G－蛋白偶聯受體受刺激后均能使P13－K磷酸化。在活化的PI3－K作用下，細胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）被磷酸化而轉換成磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），細胞質內的AKT因而被募集到細胞膜并通過氨基末端的PH結構域和PIP3結合并發生構象改變，PDK1（3－phosphatide－dependent kinase，磷脂酰激酶依賴激酶1）得以靠近、催化AKT的thr308磷酸化。但是AKT的完全活化還需要Ser473的磷酸化，后者的磷酸化相對復雜，研究者們曾經推測其磷酸化調節可能與一種假想的名為PDK2的激酶有關，但實際上后來的研究證明依據刺激和環境的不同[8，9]，參與催化該位點的酶是 mTORC2或者 DNA－PK。AKT完全激活后進一步介導其下游信號的級聯反應，參與調控細胞的存活、增殖、遷移、分化以及其他細胞代謝活動。隨著研究的深入，越來越多的蛋白分子被鑒定為AKT信號通路的特異性下游底物，包括目前研究較多的：促凋亡因子BAD、胱天冬蛋白酶9（caspase－9），促凋亡轉錄因子Forkhead家族，促生存信號NF－κB，雷帕霉素（mTOR）以及與糖代謝有關的糖原合成激酶－3（GSK－3）等。

PTEN則是AKT信號通路中重要的負性調節分子，通過將PIP3去磷酸化為PIP2來實現對PI3－K的負調節，此外，PP2A和PHLPP1／2分別通過誘導thr308、Ser473的去磷酸化而使 AKT鈍化，也起到負性調節作用[10]。人工合成的LY294002是PI3－K的特異性抑制劑，通過阻斷PI3－K而實現對PI3－K／AKT信號通路的抑制。

2 AKT信號通路在干細胞增殖中的作用

干細胞可以分為三類：全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞；依據其所處的發育階段則分為胚胎干細胞和成體干細胞。近年來干細胞在再生醫學研究方面顯示出廣闊的臨床應用前景，成為其中最前沿，最具活力和影響力的研究領域之一[11]。

盡管自我更新和增殖是干細胞的固有性質，但目前對調控其增殖的信號通路及分子機制并不完全清楚。近年來的研究發現AKT信號通路及其下游蛋白的磷酸化表達水平可能決定著干細胞的命運，在維持干細胞未分化狀態、調節干細胞自我更新和增殖中起關鍵作用。

2.1 胚胎干細胞 1998年James等首次成功建立了人胚胎干細胞系，將人卵體外受精培育至早期胚泡，提取內細胞群，最終得到了5個人胚胎干細胞系[12]。然而，胚胎干細胞體外培養擴增時極易分化為其他細胞，限制了干細胞移植的臨床應用。

早在1999年，Sun等[13]在研究小鼠胚胎干細胞時就發現，PTEN基因缺陷的細胞完成一個細胞分裂周期的時間較正常時減少5%～10%。這項研究第一次使人們認識到PI3－K／AKT信號通路可能在胚胎干細胞的增殖調控中發揮重要作用。隨后的研究進一步證實了這個發現，當用PI3－K特異性抑制劑LY294002處理后，胚胎干細胞的增殖減慢，細胞富集于G1期[14]。周睿卿等[15]以胎鼠成纖維細胞作為飼養層，二維培養的方法培養人胚胎干細胞并觀察其生長狀態，以飼養層細胞、腫瘤細胞K562細胞株作為對照，結果發現，人胚胎干細胞在未分化狀態時Pten抑制的PI3－K／AKT／mTOR信號通路下游磷酸化關鍵蛋白活性較低。研究者推測，PI3－K／AKT／mTOR信號通路在胚胎干細胞的自我復制和分化中起到重要作用，更由此猜想如果抑制負調節蛋白PTEN或直接激活該通路正調節關鍵蛋白，可能會加快人胚胎干細胞增殖、減少凋亡。

2.2 成體干細胞 腦缺血等損傷可以激活成年大腦內源性神經干細胞，促使其增殖、產生新的神經元并向損傷部位募集，這種現象在側腦室外側壁的室管膜下區（SVZ）和海馬齒狀回顆粒下層（SGZ）尤其明顯[16，17]。但是這種調控機制至今仍未完全闡明，研究表明微環境的改變、神經營養因子以及信號轉導通路等可能都參與其中7年，Kitagawa等首次報導在永久性大鼠大腦中動脈缺血模型中觀察到PI3－K／AKT信號通路的激活，這提示AKT信號通路可能在神經干細胞的增殖方面起作用[18]。隨后的大量研究證實這種內源性的干細胞增殖調控涉及多條信號通路，其中由生長因子激活的PI3－K／AKT信號通路可能在干細胞生長、存活以及增殖中扮演重要角色[19－21]。這在趙宇等[22]體外培養的大鼠神經干細胞實驗中也得到證實，應用不同濃度梯度的PI3－K特異性抑制劑LY294002孵育后進行細胞存活、增殖等檢測，結果發現LY294002阻斷AKT信號通路呈劑量依賴性，且隨著濃度升高，p－AKT含量降低，大鼠神經干細胞的增殖受到明顯抑制。

此外，有關AKT信號通路參與其他成體干細胞如心臟干細胞、間充質干細胞、造血干細胞等增殖調控的相關報道也有許多。成熟的心臟組織中仍然存在少量干細胞，有研究表明其數量只占正常心肌細胞的1%[23]。趙嵐等[24]證實，心肌梗死同樣促進內源性心臟干細胞增殖，PI3－K／AKT信號通路參與了大鼠心肌梗死后心臟干細胞的動員調節。在大鼠冠脈阻塞模型中觀察到，急性缺血誘導局部心肌AKT表達水平和干細胞數量同步進行性升高，AKT抑制劑顯著抑制上述各項指標的動態演變，使心肌梗死面積進一步惡化。Gharibi等[25]利用血小板源生長因子受體β體外培養人間充質干細胞，發現P13－K／AKT／mTOR以及下游相關蛋白p70S6K和4E－BP1與干細胞增殖調控有關，另一條信號通路ERK則介導間充質干細胞的分化。Perry等[26]揭示 Wnt（β）－catenin和 PI3－K／AKT 信號通路的共同作用下，造血干細胞才能實現自我更新和擴增。

同樣有研究報導稱AKT信號通路與干細胞的分化密切相關。Isomoto等[27]應用 mTOR特異性抑制劑rapamycin阻斷PI3－K／AKT／mTOR信號通路后發現成骨分化受抑制，這提示PI3－K／AKT／mTOR信號通路的活化與成骨前體細胞即間充質干細胞的分化有關。國海東等[28]研究表明在骨形態發生蛋白－2（BMP－2）誘導的骨髓源性心肌干細胞向心肌細胞分化中，PI3－K／AKT信號通路發揮了重要的調控作用。成體干細胞在發育過程中，既要維持自我增殖，又要進一步分化為各種類型細胞，在其分化和增殖之間應該存在著一種平衡調節機制，可能AKT信號通路正是這種平衡途徑之一。

3 AKT信號通路與腫瘤發生

近年來AKT信號通路與腫瘤發生的關系也日益受到人們的關注。AKT的過度表達或者PTEN等負調控機制的失活與惡性腫瘤的發生密切相關，在多種惡性腫瘤中可以檢測到該通路信號蛋白及其調節分子的異常表達[29，30]。蔓小紅等[31]研究發現，尖銳濕疣和宮頸鱗狀細胞癌中PI3－K／AKT信號通路被異常激活，HPV有可能通過影響PI3K和P－AKT的表達上調進而引起感染上皮的異常增殖。研究已經證實PI3－K／AKT信號通路參與調節腫瘤細胞的增殖、存活和遷移，目前以該通路及其關鍵分子為治療靶點的腫瘤治療新策略也成了研究熱點。張輝等[32]的研究表明，AKT激酶在前列腺癌生長、發展以及激素依賴性向激素非依賴性的轉變過程中起著重要作用。p－AKT蛋白磷酸化水平在AKT磷酸化激活過程中占主導地位，是AKT激活的必要過程。米非司酮抑制前列腺癌PC－3細胞的增殖，誘導細胞凋亡，其機制可能是通過抑制AKT信號轉導通路，從而激活Caspase。

4 中醫中藥

最近天津中醫藥大學的一個研究小組從傳統中藥丹參中提取出了45種活性成分[33]，一一檢測其對于體外培養的神經干／祖細胞的增殖誘導能力，篩選結果提示丹酚酸B對神經干／祖細胞具有促進增殖作用，并且這種促進作用呈時間－劑量依賴關系，其調控的分子機制可能與PI3－K／AKT信號通路有關；動物實驗也證實丹酚酸B可以通過干預PI3－K／AKT信號通路介導短暫性腦缺血大鼠模型大腦神經干細胞的自我更新和增殖。丹參抗肝纖維化的作用已經被證實，丹參的水溶性有效成分丹參素具有保護肝細胞，顯著抑制肝星狀細胞增殖并促進其凋亡的作用[34]。王玨等[35]研究提示不同濃度的丹參素和渥曼青霉素作用于肝星狀細胞24h后，細胞中磷酸化AKT（p－Akt）表達隨藥物濃度增加表達逐漸減弱，這說明丹參素和渥曼青霉素對肝星狀細胞增殖的抑制作用與其抑制PI3－K／Akt信號通路中AKT的活化有關。賴真等[36]研究發現，黃芪可刺激PI3－K／AKT信號通路的表達，減輕大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡。

5 展 望

目前的研究揭示AKT信號通路參與了干細胞的自我更新和增殖調控，未來研究的一個方向極有可能以此為調控靶點，篩選藥物，提高干細胞的增殖率，進而為干細胞治療和再生醫學提供更多的細胞來源，使干細胞療法在“不治之癥”的治療方面得到更廣泛的應用。Jun等[37]研究發現，原釩酸鈉通過干預AKT和ERK信號通路促進中風大鼠大腦SVZ區的神經前體細胞增殖。由此推測，原釩酸鈉可能因此成為治療腦中風的潛在藥物。但是這種調控機制是非常復雜的，可能不止涉及一條信號通路，而是多條通路的相互作用、相互影響。有關干細胞增殖的精確調控機制以及胞內信號通路間的相互作用尚有待進一步的研究證實。

小鼠AKT基因敲除實驗表明PI3－K／AKT信號通路的正常表達維持細胞的生存、代謝和分化，但是AKT的持續異常活化介導的抗凋亡、促增殖等作用卻與腫瘤發生密切相關。由此可知AKT信號通路是一把雙刃劍，如何控制干細胞的增殖和分化，真正使基礎研究成果轉向臨床應用，不僅需要更加廣泛深入的研究，更需要慎重的科學態度。

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