Wn t-1蛋白在宮頸鱗癌及癌前病變中的表達及意義

孫錦川 鄭曙民

山西醫科大學山西省腫瘤醫院婦一科，山西太原 030001

Wn t-1蛋白在宮頸鱗癌及癌前病變中的表達及意義

孫錦川 鄭曙民▲

山西醫科大學山西省腫瘤醫院婦一科，山西太原 030001

目的 探討Wnt-1蛋白在子宮肌瘤組織，宮頸病變組織（上皮內瘤變和宮頸鱗癌）中的表達及意義。方法取同期因子宮肌瘤行子宮全切的患者30例，宮頸上皮內瘤變患者（CIN）63例，宮頸鱗癌患者51例，術前均未接受放化療，或其他治療。用免疫組化SABC法對Wnt-1蛋白在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變（CIN）組織和宮頸鱗癌組織中的表達水平進行檢測。結果宮頸病變組Wnt-1表達明顯高于子宮肌瘤組，差異有統計學意義（P<0.001）；Wnt-1表達高度病變組高于低度病變組，差異有統計學意義（P=0.048），宮頸鱗癌組高于低度病變組，差異有統計學意義（P<0.001）；宮頸鱗癌組高于高度病變組（P=0.039）。結論 Wnt信號通路的主要成員Wnt-1蛋白的過高表達與宮頸病變的發生、發展有關。

宮頸上皮內瘤變；宮頸癌；Wnt經典信號通路；Wnt-1蛋白；免疫組化法

宮頸癌是危害女性生命健康的惡性腫瘤之一，在導致婦女死亡的惡性腫瘤中居排第2位，僅位于乳腺癌之后[1]。近幾年來，全世界宮頸癌的發病率呈現明顯上升及低齡化趨勢。Wnt蛋白在Wnt信號通路中起到重要作用，通過與細胞膜上的受體結合，從而使胞內信號傳導分子活化，進而調節靶基因的表達，參與經典Wnt信號通路的蛋白質主要有Wntl、Wnt3a和Wnt8。采用免疫組化SABC法，檢測Wnt-1蛋白在宮頸病變組（宮頸上皮內瘤變、宮頸鱗癌組織）和正常宮頸組織（子宮肌瘤）中的表達，進而探討Wnt蛋白在宮頸病變進展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

取2011年8月～2012年10月山西省腫瘤醫院病理科婦科手術切除的子宮頸鱗癌組織蠟塊51例、宮頸上皮內瘤變組織63例（低度病變組28例，高度病變組35例），隨機選取正常子宮頸組織蠟塊（同期因子宮肌瘤而非子宮頸病變行子宮全切術）30例作為對照，年齡為25～72歲，平均（36.5±7.5）歲。所有患者均未經放化療，術后均經病理證實。各組一般情況差異無統計學意義。

1.2 主要試劑

兔抗人Wnt-1多克隆抗體購為北京博奧森生物技術有限公司產品，二抗鼠抗兔即用型SABC試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產品。

1.3 實驗方法

切片常規脫蠟，水化，PBS洗兩次各5分鐘，配置3%H2O2，抗原修復，PBS洗5 min。滴加正常山羊血清封閉液，甩去多余液體，滴加一抗（Wnt-11∶150）4℃過夜，37℃復溫，PBS洗 3次，每次2 min，滴加生物素化二抗，PBS洗2 min×3次，滴加試劑SABC，PBS洗5 min×4次，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，脫水、透明，封片，PBS代替一抗做陰性對照。

1.4 陽性結果判定

經免疫組化分析，Wnt-1蛋白主要定位于細胞質，陽性染色以細胞質出現棕黃色顆粒為標準。分級標準，陽性細胞數≤2%：0分；2%～20%：1分；21%～50%：2分；≥50%：3分。著色程度，無著色：0分；淡黃色：1分；棕黃色為2分。最后得分為陽性細胞數以及著色程度相加值，陰性（-）：≤1.9 分；弱陽性（+）：2.0～2.9 分；陽性（++）：3.0～3.9 分；強陽性（+++）：≥4 分。

1.5 統計學處理

數據統計采用SPSS 16.0軟件包檢驗。Wnt-1蛋白表達數據為等級資料，差異比較采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組Wnt-1表達差異有統計學意義（χ2=58.610，P<0.001）。進一步做兩兩比較：低度病變組、高度病變組、宮頸鱗狀癌組Wnt-1表達明顯高于正常組，差異均有統計學意義（P<0.001）；高度病變組高于低度病變組，差異有統計學意義（P=0.048），宮頸癌組高于低度病變組，差異有統計學意義（P<0.001）；宮頸癌組高于高度病變組（P=0.039）。見表1。

表1 3組Wnt-1表達情況比較[n（%）]

3 討論

已有文獻報道，經典的Wnt信號通路的激活與一系列腫瘤的發生、發展密切相關。Wnt信號通路是一個復雜的蛋白質網絡，正常情況下對胚胎發育和成人部分組織的形成及功能起著重要作用，例如在細胞的增殖、分化和遷移起到一定的調節作用。目前已知的主要有19種Wnt蛋白，其中激活經典通路的有Wnt1，Wnt3a和Wnt8。Wnt1該基因編碼370個氨基酸序列，它的異常表達與人類某些系統腫瘤的發生發展密切相關。本研究發現，Wnt-1蛋白在子宮肌瘤組織中的表達水平明顯低于其在高度病變組織和宮頸鱗癌組織中的表達，趙蘇云等[2]證明子宮肌瘤細胞中存在Wnt信號通路，而正常子宮肌層組中不存在，說明Wnt信號通路與子宮肌瘤的發生密切相關；Dimitrova IK等[3]也證明，Wnt-1蛋白在子宮肌瘤中低表達并與細胞的侵襲轉移有關。在宮頸病變的發生、發展過程中，Wnt/β-catenin信號轉導途徑即經典的Wnt信號途徑起重要作用，正常宮頸組織中，βcatenin蛋白在上皮細胞膜表達，而在宮頸上皮內瘤變細胞或癌細胞中β-catenin蛋白則在細胞漿或細胞核表達，正常情況下，胞質中β-catenin蛋白的Ser45被酪蛋白激酶I磷酸化，之后與Axin-APC-GSK-3β形成降解復合物，βcatenin蛋白繼而被GSK-3β磷酸化，后結合泛素化蛋白被泛素化[4-5]。研究發現60%的低度病變可以自然消退，而5%～10%的能夠發展為高度病變，只有低于1%的患者最后發展為宮頸癌[5]，持續感染高危型HPV容易導致宮頸病變，是目前已經明確的導致宮頸癌發生的一個重要的生物學因素，但卻不是導致宮頸癌發生的完全條件。Uren 2005年發表于《Cancer Research》的文章中提到，人乳頭瘤病毒（HPV）誘導的永生化人角質化細胞被SV40 small-t（smt）抗原轉化，轉化后的細胞胞質中β-catenin蛋白高水平的表達，而胞質中β-catenin蛋白的積累，可以激活Wnt信號途徑，因此認為HPV感染陽性的正常宮頸細胞轉變為HPV永生化角質細胞需要第二次激活，即經典的Wnt信號通路的激活[6]。Theodore Rampias等[7]2010年在《Molecular Cancer Research》中也有報道，HPV病毒的E6、E7基因的表達激活經典的Wnt信號通路，因此高危型HPV感染本身足以致癌。

大量文獻表明經典的Wnt信號途徑異常在腫瘤的發生發展中起重要作用，尤其是對于結腸癌的研究報道較多，近年來對Wnt-1蛋白在胃癌中也有相關報道，韓向春等[8]報道，在經典Wnt信號通路中，Wnt1在胃癌中高表達，與正常組織相比，差異具有統計學意義。但對于該信號通路各個分子在引起子宮腫瘤的過程中所起作用的研究并不多見，通過對其作用的研究，進一步明確其相關機制，未來可將它作為治療宮頸癌的重要靶點，通過對該途徑的干預調控從而達到治療腫瘤的目的。這可以成為未來的一個研究熱點。本研究30例子宮肌瘤組織中，Wnt-1蛋白陽性率較低，而在宮頸低度病變組織、宮頸高度病變組織、宮頸鱗癌組織中，其陽性率則逐漸增加。由于樣本的不足，本實驗無法探討Wnt-1蛋白在宮頸腺癌組織中是否也有此表達傾向。

[1]Parkin D M，Bray F，Ferlay J，etal.Estimating the world cancer burden：Globocan 2000[J].Int J Cancer，2001，94（2）：153-156.

[2]趙蘇云，李美蓉.Wnt信號通路在子宮肌瘤中的表達[J].山西醫藥雜志，2009，38（5）：410-411.

[3]Dimitrova IK，Richer JK，Rudolph MC，et al.Gene expression profiling of multiple leiomyomata uteri and matched normal tissue from a single patient[J].Fertil Steril，2009，91（6）：2650-2663.

[4]Price MA.CKI：there’S more than one：casein kinase I family members in Wnt and Hedgehog signaling[J].Genes Dev，2006，20（4）：399-410.

[5]Syrjallen KJ.Spontaneous evolution of intraepithelial lesions according to the grade and type of the implicated human papillomavirus（HPV）[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，1996，65（1）：45-53.

[6]Uren A，Fallen S，Yuan H，et al.Activation of the canonical Wnt pathway during genital Keratinocyte transformation：A mode for cervical cancer progression[J].Cancer Res，2005，65：6199-6206.

[7]Theodore Rampias，Eleni Boutati，et al.Activation of Wnt Signaling Pathway by Human Papillomavirus E6 and E7 Oncogenes in HPV16-Positive Oropharyngeal Squamous Carcinoma Cells[J].Molecular Cancer Research，2010，8（3）：433-443.

[8] 韓向春，康金旺，鄭力強，等.Wnt1、β-catenin、APC 和 cyclin D1蛋白在胃癌中的表達[J].腫瘤防治研究，2011，38（2）：163-166.

The expression and mean of Wnt-1 in cervical carcinoma and precancerous lesion

SUN Jinchuan ZHENG Shuming▲
Department of Gynaecology,the Shanxi Cancer Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

ObjectiveTo investigate the expression of Wnt-1 in patients with fibroid and cervical lesion (cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma).MethodsFibroid tissue were selected from 30 fibroid patients who underwent hysterectomy from our department in the same period and Cervical intraepithelial neoplasia(CIN)were chose from 63 patients while cervical squanlous cell carcinoma(SCC)were picked from 51 cases of patients,none of them

any treatment such as preoperative radiothe-rapy or chemotherapy.To detect Wnt-1 by immunohistochemistry(SABC)in fibroid tissue,cervical intraepithelial neoplasia and cervical squamlous cell carcinoma.ResultsThe expression positive rate of Wnt-1 protein in cervical lesion tissues were significantly higher than that in fibroid tissues,and the differences were statistically significant(P<0.001).HSIL group were higher than the low-grade lesions,the difference was statistically significant(P=0.048);squamous cell carcinoma of the cervix were higher than low-grade lesions group,the difference was statistically significant(P<0.001);cervical squamous cell carcinoma group were higher than HSIL group (P=0.039).ConclusionWnt-1 protein,the main members of the Wnt signaling pathway,play an important role when it is over expression in the cervical lesion progress.

Cervical intraepithelial neoplasia(CIN);Cervical squanlous cell carcinoma;Wnt signal path;Wnt-1;Immunohistochemist

R737.3

A

1674-4721（2013）04（b）-0042-02

孫錦川（1989-），學歷：碩士；研究方向：婦科腫瘤方向。▲

2013-02-01 本文編輯：魏玉坡）