一種幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養和保存方法介紹

張麗花

江蘇省張家港市第一人民醫院檢驗科，江蘇 張家港 215600

一種幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養和保存方法介紹

張麗花

江蘇省張家港市第一人民醫院檢驗科，江蘇 張家港 215600

目的：介紹一種幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）臨床菌株的分離培養和保存方法。方法：采用心腦浸液瓊脂培養基，同時以微需氧盒和微需氧袋對50份臨床標本培養HP，并以心腦浸液液體培養基保存菌株。結果：微需氧盒中共檢出23份HP陽性，而微需氧袋中只檢出3份HP陽性。心腦浸液液體培養基保存菌株復蘇成功率為95.6%。結論：心腦浸液瓊脂培養基微需氧盒法可以成功分離培養HP，心腦浸液液體培養基保存菌株復蘇成功率高。

幽門螺桿菌；分離培養；菌種保存

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）是一種螺旋狀、革蘭染色陰性、微需氧的細菌，由Warren和Marshall于1983年成功從胃黏膜組織中分離［1］?，F已證實HP與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴樣組織（MALT）淋巴瘤以及胃癌密切相關，1994年世界衛生組織／國際癌癥研究機構（WHO／IARC）將其列為胃癌的I類致癌因子［2－4］。目前有多種方法可用于診斷HP感染，細菌培養被視為診斷HP感染的金標準［5］，也是HP研究工作的基礎。但由于HP的培養條件要求較高，抵抗力較低，導致許多實驗室不易獲取或保存HP菌種，從而影響研究工作的開展。本文介紹一種簡便的HP臨床菌株分離培養和保存的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 本院胃炎、消化道潰瘍患者在胃鏡檢查時取下的胃和十二指腸活組織標本50例。病人受檢前2周未服用抗生素、非甾體類抗炎藥、質子泵抑制劑、黏膜保護劑等。

1.1.2 心腦浸液瓊脂培養基 稱取23.5g心腦浸液瓊脂（OXOID CM0375）在500ml蒸餾水中，煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15分鐘。取出自然冷卻至50℃，加入2ml幽門螺桿菌選擇劑（萬古霉素Vancomycin 5mg、頭孢磺啶Cefsulodin 2.5mg、磺胺增效劑Trimethoprim 2.5mg、兩性霉素B Amphotercin B2.5mg，溶于2ml無菌蒸餾水中），再加入35ml（7%）脫纖維羊血，混勻后澆平板。

1.1.3 心腦浸液液體培養基 稱取0.37g心腦浸液肉湯（OXOID CM0225）于50毫升的小燒杯中，再加入10毫升蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻。把上述溶液轉入三角燒瓶中，連同1ml EP管、甘油一同高壓滅菌。在EP管中加入0.8ml液體培養基、0.05ml胎牛血清、0.15ml甘油，用來保存HP。

1.1.4 微需氧產氣盒（袋） 法國生物梅里埃微需氧產氣盒（袋）（GENbox／bag microaer）和微需氧氣體產生囊。

1.2 方法

1.2.1 培養 將胃或腸組織塊放入1ml無菌生理鹽水中，充分振搖后取各100μl加入二塊相應的心腦浸液瓊脂平板中，涂抹均勻；兩塊平板分別放入微需氧盒和微需氧袋（含5%O2、10%CO2、85%N2），快速地將氣體發生器放入微需氧盒和微需氧袋，再取一塊紗布，用蒸餾水浸濕，避開氣體發生器，放入微需氧盒和微需氧袋中，37℃培養3～7天。

1.2.2 菌株鑒定 觀察平板，挑取可疑菌落，革蘭氏染色，觸酶試驗，氧化酶試驗，脲酶試驗。

1.2.3 菌株保存 挑取少量HP細菌加入含心腦浸液液體培養基的EP管中，充分混勻，用封口膠封閉、標記；放入－70℃速凍冰箱中冷凍保存。

1.2.4 菌株復蘇 取出菌種，在固體培養基平板中加入1滴菌液，用接種環涂勻，放入微需氧盒，37℃培養3～5天。

2 結果

經過3～7天培養，產氣盒中共檢出23份HP陽性，而產氣袋中只檢出3份HP陽性。HP在心腦浸液瓊脂培養基上生長緩慢，37℃培養3～5天后才能發現針尖大小，透明無色，呈露滴狀，不溶血的菌落。觸酶、氧化酶、脲酶試驗陽性，革蘭氏染色為陰性的彎曲桿菌，鑒定為HP。

將保存有HP的EP管從中取出，待溶解后接種心腦浸液瓊脂培養基，37℃培養3～5天后，細菌生長狀況良好。復蘇成功率為95.6%。

3 討論

HP是一種生存、生長條件都非常苛刻的細菌，對培養基及培養條件要求很高，較一般細菌難以培養［6－7］。但HP培養還有供純化、保存、分型以及細菌特性和致病機制研究等多種科研用途。隨著HP耐藥菌株的日益增加，HP培養還能提供細菌耐藥性的資料，這對指導臨床用藥極為重要［8－10］。目前，由于各種條件的限制，我國HP培養主要在大學附屬醫院和科研機構進行，這使許多醫院不能進行HP的藥敏測試，導致臨床上治療HP感染時，多憑臨床經驗選擇抗生素，有較大的盲目性。我們運用心腦浸液培養基和微需氧產氣盒的方法進行HP的培養，方法簡單，分離效果較好。對于現有醫院普通微生物室來說，不需要另外增加儀器設備，就可以進行HP的常規分離培養。在心腦浸液培養基中加入萬古霉素、頭孢磺啶、磺胺增效劑、兩性霉素B后，對混有其他雜菌的標本更能得到滿意的分離培養效果。

我們運用了產氣盒和產氣袋二種培養容器進行培養效果的比較，顯示運用產氣盒能得到較好的分離效果，這可能與產氣袋密封性不如產氣盒有關，很難維持一個微需氧的環境有關。另外，在HP的分離培養中，還應注意幾點：①標本必須新鮮，運送時間不可超過3小時，標本必須置入含有2ml以下的無菌生理鹽水或20%葡萄糖中，并保持溫度在4℃；②將標本在無菌研磨器研磨后接種，比直接涂抹平板更能得到較佳的分離效果；③心腦浸液培養基必須新鮮配制；④培養在37℃的微需氧環境中要保持非常潮濕的環境，可以在盒底放紗布并加足量的水分。

［1］Warren JR，Marshall BJ.Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis［J］.Lancet，1983，1（8336）：1273－1275.

［2］王仙云，郭愛軍，熊自忠.幽門螺桿菌致胃癌的相關研究進展［J］.安徽醫藥，2011，15（5）：630－641.

［3］Infection with Helicobacter pylori.IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans Schistosomes，1iver flukes and Helicobacter priori.IARC monographs On the evaluation of carcinogenic risks to humans［M］ VOl61 Lyon：International Agency for Research On Cancer，1994：177－240.

［4］周政，劉有理，王光明，等.幽門螺桿菌感染與胃食管反流的關系［J］.安徽醫藥，2013，17（3）：436－437.

［5］張萬岱，蕭樹東，胡伏蓮，等.對幽門螺桿菌若干問題共識意見［J］.世界華人消化雜志，2004，12（10）：2457.

［6］萬學勤，周鵬志，馬峰，等.燭缸法分離培養及冷凍法保存幽門螺桿菌［J］.佛山科學技術學院學報，自然科學版，2011，29（5）：82－85.

［7］劉琳娜，丁士剛，張靜，等.幾種培養幽門螺桿菌方法的比較［J］.胃腸病學，2012，17（4）：240－241.

［8］呂農華，祝蔭.幽門螺桿菌耐藥的現狀與對策［J］.中華消化雜志，2011，31（1）：66－68.

［9］謝昆華.幽門螺桿菌耐藥現狀及臨床治療對策［J］.中國臨床新醫學，2011，4（1）：90－93.

［10］劉苓，胡林，劉婭琳，等.貴州省幽門螺桿菌臨床菌株的抗生素耐藥現狀［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2012，21（8）：702－705.

R378

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1007－8517（2013）16－0052－02

2013.06.10）

張麗花（1971－），女，本科，副主任技師。研究方向：臨床免疫學檢驗。