前列腺切除術后尿道修復的動物實驗

唐小虎羅光恒

1.遵義醫學院，貴州 遵義 563003；貴州省人民醫院泌尿外科，貴州 貴陽 550002

前列腺切除術后尿道修復的動物實驗

唐小虎1羅光恒2

1.遵義醫學院，貴州 遵義 563003；貴州省人民醫院泌尿外科，貴州 貴陽 550002

目的：探討前列腺切除術后前列腺部尿道再上皮化來源、過程、機制，以及前列腺部相關干細胞是否參與修復過程。方法：建立2微米激光犬前列腺切除模型，術后3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、12周在膀胱鏡下觀察前列腺部尿路上皮的修復過程，在創面部位取活檢標本，行HE染色以及免疫組化（PSA、CK34、P63、CD133和UPS），在顯微鏡下觀察尿路上皮的修復過程。結果：膀胱鏡和顯微鏡下均未發現前列腺切除術后創面周圍正常尿路上皮向創面爬行生長，而尿路上皮再生的主要細胞來源于前列腺細胞。再生的尿路上皮隨著修復的進行逐漸表達UPS、P63、CK34、CD133，但不表達PSA。結論：前列腺切除術后前列腺部尿道的再上皮化來自于創面周圍正常的尿路上皮可能性小，尿道再上皮化的重要細胞來源可能是前列腺組織細胞，而前列腺部的相關干細胞可能參與修復過程。

尿路上皮；再上皮化；良性前列腺增生；干細胞

良性前列腺增生切除術后前列腺部存在著術后創面、尿道水腫、壞死組織，前列腺部的尿路上皮再生后有助于創面的封閉，使尿道的結構和功能都逐漸恢復至正常。尿路上皮再生是良性前列腺增生術后尿道修復的關鍵。

傳統的觀點認為良性前列腺增生切除術后膀胱頸口的正常尿路上皮是前列腺尿路上皮再上皮化的主要來源。但前列腺切除術后的修復方式目前還沒有統一的結論，Eduardo［1］等就認為尿道再上皮化的原因是由于殘余的腺泡和導管上皮組織增生的細胞遷移而來，同時他們的研究還表明激光熱凝固和TURP是部分皮層損傷，類似于II度皮膚燒傷。

成體干細胞已經在很多成體組織中發現，包括表皮干細胞［2］、間充質干細胞［3］、造血干細胞［4］等。同樣，目前的研究也表明前列腺部也可能存在著成體干細胞，它的位置可能位于前列腺基底細胞層，并且可能與良性前列腺增生和前列腺腺癌的發生發展相關［5－6］。前列腺成體干細胞有可能參與前列腺切除術后尿道修復的過程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年未去勢雄性家犬30只，年齡大小約6歲，體重18～22kg，遵義醫學院本部校區實驗動物場提供。

1.2 設備 德國產的Revolix 2μm連續波醫用激光手術治療系統，功率120W，通過550微米的光纖傳輸能量。24F 12°激光電切鏡（德國Wolf公司）。灌洗液為無菌等滲平衡液。

1.3 建立前列腺切除術后模型 家犬10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉后仰臥位固定于手術臺上，下腹部正中切口暴露膀胱。于膀胱前壁預置一荷包縫合線，在荷包縫合中央切開膀胱壁，插入激光電切鏡，然后收緊荷包縫合線。以生理鹽水作為沖洗液，直視下電切鏡由尿道內口進入前列腺部尿道，手術方式模擬體內汽化切除術，持續移動光纖，完成弧形汽化切除，精確切割時將光纖頭埋于前列腺組織中，潛行切割，深約1～2mm，切除前列腺部全部尿路上皮和大部分前列腺組織，避免損傷前列腺包膜。術畢縫合膀胱，關閉腹腔。術后均不留置導尿管。

1.4 方法 術后3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周和12周電切鏡觀察并序貫取材，完成前列腺部尿路上皮 HE染色，觀測尿路上皮病理變化和分子標記（UPS、PSA、CD34和CD133）的表達變化。

2 結果

2.1 術后前列腺部尿路上皮修復過程 創面從蒼白逐漸變紅潤，滲血逐漸停止，血塊逐漸消失，大量蒼白壞死組織覆蓋在術后創面上并突向尿道腔，隨著修復的進行逐漸脫落，創面逐漸覆蓋正常尿路上皮，創面和正常尿路上皮由分界明顯變為分界模糊，未見前列腺部遠端正常尿道或膀

胱頸口正常尿路上皮向創面爬行生長。

2.2 前列腺部尿路上皮細胞組織形態學變化 術后創面尿路上皮缺損，無新生上皮細胞形成，有凝固性壞死組織附在創面上，創面周圍分布有大量炎性細胞 （中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞），離創面越近炎性細胞越密集，隨著修復的進行，炎性細胞逐漸減少，創面上逐漸出現新生上皮細胞，由點狀逐漸連成片狀，進而覆蓋整個創面，并逐漸增厚、出現極性，能表達尿路上皮特殊的蛋白。

2.3 前列腺部尿道免疫組化結果

2.3.1 P63在正常尿路上皮的表達 P63是核蛋白，陽性染色區在尿路上皮的細胞核，陽性代表細胞是上皮來源。正常前列腺部尿路上皮連續的基底細胞細胞核被染成黃褐色。

2.3.2 P63在前列腺切除術后尿路上皮的表達 術后3天未見前列腺切除術后的尿道創面出現表達P63陽性的細胞；術后1周見術后創面出現新生的表達P63陽性的細胞，呈島狀分布；術后2周術后創面新生的表達P63陽性的細胞呈線性覆蓋整個創面，和周圍正常的尿路上皮相連續；術后3周至12周表達P63陽性的基底細胞都成線性覆蓋在創面上并逐漸成熟。

2.3.3 CK34在正常尿路上皮的表達 CK34是一組高分子細胞角蛋白，在前列腺基底細胞質中表達，而在分泌上皮細胞不表達。

2.3.4 CK34在前列腺切除術后尿路上皮的表達 術后3天未見前列腺切除術后的尿道創面出現表達CK34陽性的細胞；術后1周見術后創面出現新生的表達CK34陽性的細胞，呈島狀分布；術后2周術后創面新生的表達CK34陽性的細胞呈線，覆蓋整個創面，和周圍正常的尿路上皮相連續；術后3周至12周表達CK34陽性的基底細胞都成線性覆蓋在創面上并逐漸成熟。

2.3.5 PSA在正常尿道的表達 PSA是前列腺腔面腺管上皮細胞分泌的胞質蛋白，在前列腺腺泡、腺管上皮胞質表達，在尿路上皮中不表達。

2.3.6 PSA在前列腺切除術后尿路上皮的表達 術后創面新生的尿路上皮中均不表達PSA。

2.3.7 UPS在正常尿路上皮的表達 尿斑蛋白是尿路上皮最顯著的結構，是它的標志蛋白，它們覆蓋大約80%的尿路上皮腔面，另外尿路上皮細胞漿的膜泡也含有大量的這種斑塊樣膜結構，在尿路上皮的細胞漿中表達。

2.3.8 UPS在前列腺切除術后尿路上皮的表達 術后3天未見前列腺切除術后的尿道創面出現表達UPS陽性的細胞；術后1周見術后創面出現新生的表達UPS陽性的細胞，呈島狀分布，厚度約1～2層細胞；術后2周術后創面新生的表達UPS陽性的細胞厚度繼續增加，覆蓋整個創面，和周圍正常的尿路上皮相連續；術后3周至12周表達UPS陽性細胞逐漸成熟并出現極性，且接近尿道腔面的細胞表達較強。

3 討論

3.1 前列腺部尿路上皮修復過程 激光熱凝固是部分皮層損傷，類似于II度皮膚燒傷［7］，我們在實驗中也觀察到尿路上皮修復過程也類似皮膚燒傷過程分為三個階段，即炎癥反應期、組織形成期、基質重建期，這三個階段在時間和空間上相互重疊［8，9］。

前列腺部尿路上皮再上皮化過程：

術后3天：創面上未見新生尿路上皮。

術后1周：島狀新生上皮細胞形成，1～2層。

術后2周：新生尿路上皮完全覆蓋創面，大多數新生上皮欠均勻，厚度4－6層，缺乏極性。

術后3周：新生上皮厚度較均勻，為6～8層，細胞初具極性，細胞體積增大。

術后4周：新生上皮厚度較均勻，為6～8層，細胞極性較前更加顯著，細胞體積增大。

術后6周：新生上皮厚度較均勻，為6～8層，細胞極性較前更加顯著，細胞體積增大。

術后8周：新生上皮厚度均勻，多為6～10層，細胞極性明顯，但細胞體積仍較大。

術后12周：新生上皮厚度均勻，多為6～10層，細胞極性明顯，細胞正常。

3.2 前列腺部尿路上皮修復機制的探索 從前列腺切除術后尿道再上皮化的過程中可以看出上皮從殘存的前列腺再生并分化為尿路上皮的可能性較大。尿路上皮最靠近尿道腔面的一層細胞是傘狀細胞，最顯著結構特點是其特異的表面膜結構，被稱為尿斑蛋白，這些尿斑蛋白在維持傘細胞功能上起著重要作用，是尿路上皮細胞分化的標志蛋白［10］。尿路上皮的各層細胞逐漸出現并極化，經過約12周的時間恢復正常并在再上皮化的過程中逐漸分化出特異性的尿斑蛋白。所以，前列腺切除術后前列腺部創面的尿路上皮再生修復可能來源于手術未切除的前列腺組織。

3.2.1 前列腺組織細胞是前列腺部尿路上皮再生的細胞來源之一 前列腺切除術后3天在創面上未見表達尿斑蛋白陽性的細胞；術后1周后殘余的前列腺組織接近創面的腺泡狀細胞和創面新生的細胞均表達尿斑蛋白陽性，創面新生的細胞呈島狀分布，約1～2層；隨著進一步修復，新生尿路上皮細胞層逐漸增厚，并出現明顯的極性，且表達尿斑蛋白陽性最強的細胞總是位于接近尿道腔面的細胞層。所以我們推測新生的尿路上皮可能來源于殘余的前列腺組織細胞。

3.2.2 前列腺相關干細胞可能是術后前列腺部尿路上皮再生的細胞來源之一 人們已經在個體生長發育的各個階段以及多個成體組織中發現干細胞，前列腺組織也可能存在發揮重要作用的干細胞。通過對鼠的研究發現位于前列腺導管的近端存在著一種具有干細胞特征的細胞群［11－12］，以及Lin VK［13］發現前列腺基質部有一種具有自我更新能力的、來源于良性前列腺增生組織的前列腺基質細胞亞群。

干細胞具有強大的增值分化能力，Taylor RA［14］等建立了上皮細胞和人類胚胎干細胞相互作用的模型，培養出了人類前列腺組織，在第8～12周時它就能表達前列腺特異性抗原。其后，Leong KG［15］等從成年老鼠前列腺中分離出具有多項分化潛能、能自我更新的細胞，移植入體內后能分化增殖為具有分泌功能的前列腺。

在實驗中我們使用了具有特異性標記物來觀察前列腺細胞參與尿道修復的過程，其中包括P63、CK34、CD133？：

①P63：p63是核蛋白，P63基因被認為是P53基因家族的新成員［16］。它在尿路上皮細胞等均有表達［17］。SIGNORETI等［18］較早發現P63在前列腺發育過程中起重要作用，并證實其在前列腺基底細胞中表達。P63缺如的鼠上皮會有各種各樣的缺陷［19－21］。P63陽性染色區在尿路上皮的細胞核。實驗中發現殘余的前列腺腺泡基底細胞就參與尿路上皮的再生過程，新生的尿路上皮細胞從一開始就表達P63陽性，這提示殘余的前列腺組織中的腺泡基底細胞可能參與前列腺部尿路上皮的再生修復過程；②CK34：細胞角蛋白是細胞骨架蛋白的一種。CK34是前列腺基底細胞的一種特異性標記物［22］，CK34蛋白為胞漿著色，在顯微鏡下觀察較P63更加直觀，實驗中發現CK34和P63的表達呈現出類似的表達規律；③CD133：它是一個五次跨膜糖蛋白，其生物學功能尚不十分清楚。在生物體液中 （如神經管液、尿液、唾液等），與CD133相關的膜顆粒隨微絨毛的退化及胚胎神經上皮細胞多形突起物的形成而脫落，說明CD133維持干細胞特性。CD133是間質干細胞的陽性標記物［23］，同樣是造血干細胞標志物，可能是某些腫瘤的腫瘤干細胞標志［24］。CD133陽性染色區在基底細胞胞質、胞核，腺體細胞的胞質。在實驗中發現增生的前列腺腺泡細胞和再生的尿路上皮均表達CD133，它不能直接提示前列腺干細胞參與尿路上皮的修復。

關于前列腺相關干細胞參與尿路上皮的再生，我們可以假設在正常情況下，由于尿路上皮具有的通透屏障作用，這些具有前列腺干細胞特征的細胞在前列腺切除后暴露在和之前不同的外環境下，如直接接觸尿液、炎癥刺激。在這些因素的刺激下前列腺干細胞從它處于相對靜止的狀態轉入活躍的狀態，開始在特定的調控機制下分化增殖，在體內特殊的外環境下向尿路上皮分化增殖，尿路上皮各層細胞逐漸增殖、成熟，最后在形態和功能上都和正常的尿路上皮一樣。

4 結論

前列腺切除術后創面附近正常的尿路上皮爬行生長覆蓋創面的可能性小，尿液中脫落的尿路上皮細胞是否參與尿路上皮的修復目前尚不能證實，而再生的尿路上皮主要來源于前列腺殘余組織，而在前列腺組織中存在的前列腺干細胞可能是這一修復過程的主要參與細胞，目前尚無發現前列腺干細胞的相關證據，但前列腺部具有干細胞相關功能的細胞是否為前列腺干細胞，能否分離后純化在體外特殊的環境下分化出尿路上皮，注射到前列腺切除術后創面能否加快新生尿路上皮的再生，以及前列腺干細胞需要怎樣的增殖分化條件，我們都將進一步探討。

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The Discussion of Urethral Repair Mechanism after Prostatectom y

TANG Xiao－hu，Luo Guang－heng
1.Zunyi Medical College，Zunyi563003，China；2.Guizhou Provincial People's Hospital，Guiyang 550002，China

Objective：Discuss the source，process，mechanism of urethra prostate epithelial regeneration，and whether prostate stem cells participate in the repair process.Methods：Establish the model of2 micron dogs’prostatectomy，after3 days，1 week，2 weeks，3 weeks，5 weeks，6 weeks，4 weeks，8 weeks and 12 weeks observed prostate urinary epithelial repair process under cystoscope，take biopsy specimen in the wound site，adopt HE staining and immunohistochem（PSA，CK34，P63，CD133 and UPS），observed urinary epithelial repair process under the microscope.Results：Under cystoscope and microscope，do not found normal urinary tract epithelium around the wound crawl to the wound after prostatectomy，and urinary tract epithelial regeneration cells mainly comes from prostate cells.Regeneration of the epithelium of the urinary tract as repair to express UPS，P63，CK34，CD133，but do not express the PSA.Conclusion：After the prostatectomy，it’s impossible of prostate urethra epithelial regeneration come from the normal urinary tract epithelium around the wound，the vital source of cells for urinary tract epithelial regeneration may be prostate cells，and prostate stem cells may participate in the repair process.

urothelium；re－epithelization；prostatic hyperplasia；Stem Cell

R697＋.3

A

1007－8517（2013）12－0056－03

2013.03.28）