股骨頭壞死動物模型研究進展

張成龍，尹 華，章建華

(1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053;2.浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江 杭州 310006)

股骨頭缺血性壞死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是由于不同的病因破壞股骨頭的血液循環造成骨細胞、骨髓造血細胞和脂肪細胞壞死的病理過程，最終導致股骨頭塌陷，髖關節功能障礙的一種疾病［1］。近年來發病率不斷增高，發病年齡趨于年輕化，因其臨床癥狀較重、致殘率高，治療困難，越來越引起醫學界的重視，其中激素性股骨頭壞死占總發病率的50%以上，并呈逐年上升的趨勢。

ONFH按照病因分類可分為創傷性股骨頭壞死及非創傷性股骨頭壞死。創傷性ONFH主要見于髖部創傷，如:股骨頸骨折、股骨頭骨折、髖關節脫位、髖臼骨折等，股骨頭由于血運中斷而發生壞死。非創傷性ONFH主要是由于激素濫用、飲酒過量、風濕病、血液病等引起。

正因為股骨頭壞死的發病機制并不明確，且缺乏切實有效的早期治療方法，所以建立與人類臨床病理特征相似的股骨頭壞死動物模型以研究其發病機制及尋求有效的治療方法顯得尤為重要。現就目前股骨頭壞死動物模型建立的研究進展綜述如下。

1 模型動物的選擇

國內外學者的研究中，選擇用來建立股骨頭壞死動物模型的動物包括四足類動物(如大鼠、兔、犬、豬、羊、馬)和雙足類動物(雞、鵝、鹋鴯)。

雙足類動物的特點是雙下肢負重，與人類的負重方式相似，突出生物力學在ONFH病程中的作用。雞的股骨頭壞死的進程與人類相似，病理變化接近人類。曾有國內外學者應用雞、鹋鴯建立激素性股骨頭壞死模型［3－4］。但是雞與人類的親緣性較遠，人們對其解剖學及生理學上的認識較少。且鹋鴯來源有限，飼養難度大，限制了其廣泛應用。

應用于ONFH造模四足類動物多屬哺乳類動物，生物進化上與人類較近。應用最多的是大鼠、兔和犬。其中大鼠的骺生長板終生存在，常用來制作兒童股骨頭骨骺壞死(Perthes'病)動物模型;自發性高血壓大鼠(SHR)易患多種骨骼疾病(包括ONFH)，可以模擬Perthes'病的自然病程;大鼠沒有嘔吐反射，用作灌胃法制作酒精性 ONFH模型，劑量確切;大鼠也用作激素性 ONFH模型建立，馬信龍等人［5］嘗試 Wistar大鼠臀肌注地塞米松磷酸鈉20mg/kg，每周1次，并每天輔以強制活動，8周后造模成功。用兔作ONFH模型的研究也較多，特別是用作激素性股骨頭壞死模型［6－10］，但兔在病程上與人類激素性股骨頭壞死病程不符，病理變化差別大;犬的體形較大，較適合于外科手術建模［11］。羊的長骨粗大，脂肪豐富，易于發生減壓性骨壞死，是制作減壓性骨壞死動物模型的最好動物［12］。豬和馬作為實驗動物建模的相對較少［13］。同時由于豬、羊等大動物成模時間長，實驗成本高，成功率較低，死亡率高，較少應用于實驗室研究。

理想的股骨頭壞死動物模型首先要求實驗動物要與人具有較好的親緣性及相似性，所選動物的解剖和生理學特點盡可能與人類相似，符合人類ONFH病變規律，即從早期的病理組織學改變到晚期的股骨頭塌陷，股骨頭壞死區域應接近軟骨面并與周圍活骨相連接，且在壞死修復過程中股骨頭應承載正常的應力;可重復性好，便于檢測評價;經濟可行。

2 造模方法

2.1 激素造模

從20世紀已經有學者用不同方法建立激素性股骨頭壞死模型。

2.1.1 單純激素誘導:趙廣輝等人對新西蘭大白兔進行每周2次的臀肌注地塞米松磷酸鈉(8mg/kg)，分別于3周、6周后觀察到股骨骨密度及組織病理學上的軟骨改變［14］。據趙金東等人研究，用40mg/kg甲基強的松龍臀肌注中國大耳白兔造模，8周后模型建立成功［15］。研究報道也有學者選擇SD大鼠造模，每周2次臀肌注醋酸潑尼松龍(24.5 mg/kg)連續6周，大鼠股骨頭骨小梁模糊，空骨陷窩率明顯升高［16－17］。

2.1.2 激素聯合馬血清誘導:模擬臨床上高免疫狀態下大劑量使用激素造成的股骨頭壞死。王偉等人應用馬血清10 mL/kg，經兔耳緣靜脈注射3周后，減量為6 mL/kg再次注射2周后，腹腔注射甲基強的松龍，按45 mg/kg連續3天，每天注射1次，可造成激素性壞死模型［18］。

2.1.3 激素聯合內毒素誘導:模擬高凝血狀態下使用激素導致的股骨頭壞死。童培健等人［19］選用Wistar大鼠，腹腔注射內毒素 20 μg/kg兩天，臀肌注甲強龍40 mg/kg三天，6周后組織病理學觀察結果顯示，模型組壞死率達70%。黃克勤等［20］研究發現，SD大鼠尾靜脈注射內毒素10 μg/kg 1次，肌注20 mg/kg甲強龍4天，6周后模型建立成功。據趙金東等人［21］研究報道顯示，對中國大耳白兔進行耳緣靜脈注射內毒素(50 μg/kg)兩天后臀肌注甲強龍(40 mg/kg)三天，4周后 MRI掃描，造模組兔T1WI表現為右側股骨頭信號減低，組織病理學觀察發現模型組骨小梁數目明顯減少，斷裂，但模型組動物死亡率較高。

激素造模法的應用越來越廣泛，但在各家報道中，建立ONFH動物模型所用激素的類型，劑量以及致ONFH發生率均不同。對激素劑量的研究方面目前還沒有大量的實驗數據證明ONFH發病的最佳用藥劑量，同時針對內毒素、激素的用量過大導致的動物死亡這方面的文獻報道也不多。因此對激素類型、用量的考察對于完善激素性股骨頭壞死動物模型的建立有著重要意義。

2.2 酒精造模

過度的酒精引起肝的損害，脂肪肝又產生了脂肪栓子。脂肪栓子對非創傷性骨壞死起關鍵作用［22］。郭天明［23］曾用雄性 Wistar大鼠每次以 56度白酒灌胃(10 mL/kg)連續兩天后停一天，持續24周后，血液生化指標顯示 HDL-C、LDL值均較正常組低;組織病理學顯示部分骨小梁出現空骨陷窩，多于50%。齊振熙等［24］對SD大鼠給予56度白酒8 mL/kg·d(含純酒精約 4 g/kg·d)灌胃，20 周后處死動物進行組織病理學觀察，發現實驗組股骨頭軟骨層較薄，軟骨下骨小梁變細，間距增大，結構紊亂，骨小梁有斷裂。

酒精性股骨頭壞死模型的建立主要問題在于灌胃劑量的選擇及造模時間。在大鼠能耐受的情況下，應盡可能采取大劑量和高頻度灌胃。但在保證實驗大鼠不發生酒精中毒致死的情況下，造模時間仍然較長，增加了飼養的難度。

2.3 創傷性造模

成年創傷性股骨頭壞死動物模型的制備有液氮冷凍法、手術破壞骨髓法、選擇性血管結扎法、局部細胞滅活法等。

2.3.1 液氮冷凍法:有學者用液氮冷凍法造成犬整個股骨頭壞死及修復反應，但壞死由外向內，且一周后即出現股骨頭外形改變和骨性關節炎［25－26］。但液氮冷凍法造成的動物股骨頭壞死模型的骨壞死與臨床有一定的差別，對臨床的指導有很大的局限性。

2.3.2 手術破壞骨髓法:李印良等［27］通過將兔圓韌帶切斷，在近股骨附著點處環形切斷結扎關節囊，股骨頸基底部鉆直徑2 mm骨孔，破壞骨髓的方法制作股骨頭壞死模型。此方法造成缺血性壞死缺點是手術創傷大，壞死的修復可能會受到多方面因素的影響，修復時間較長，不利于短期內觀察其完整的修復過程。

2.3.3 選擇性血管結扎法:Nakamura等［27］結扎狗股骨頭周圍血管，并使髖關節后脫位9 h，術后3 d、1、2、4周進行 MRI及組織切片觀察，組織切片3 d開始出現異常，MRI 1周開始出現異常。動脈和靜脈的結扎雖然能引起骨壞死，但造模時間長，骨的修復較為明顯，造成的模型往往不典型。

2.3.4 局部細胞滅活法:彭吾訓等［28］將微波天線插入兔股骨頭進行微波滅活，1、2、4、8和12周后利用X射線、MRI檢測股骨頭影像。55℃，10 min微波滅活后，4周時壞死與修復同時進行，8周時壞死骨小梁及骨髓組織完全吸收，12周時骨修復停止，骨壞死繼續，股骨頭開始塌陷。楊明亮等［29］則利用家兔股骨頭內注射鹽酸、氫氧化鈉的方法造模，6周左右即可出現典型的骨壞死。但滅活法與人類臨床的發病過程不一致，對于臨床股骨頭壞死病程發展及治療方法研究指導意義不大。

3 ONFH動物模型評價指標

在股骨頭壞死的實驗研究中，判定動物模型是否復制成功，是至關重要的一步。對模型的評價指標有以下研究:

3.1 大體觀察及X線片

已造成股骨頭壞死的模型股骨頭松脆，易于剖開鑿切。X線往往顯示股骨頭周圍骨質變疏松，骨皮質變薄，骨小梁模糊不清或消失，股骨頭內有散在低密度區的表現。但此項指標不適用于早期股骨頭壞死的診斷。

3.2 組織形態學檢查

賀西京等［30］于光鏡下觀察了壞死的股骨頭組織，發現第4周開始，軟骨下骨區骨小梁部分骨細胞核固縮，胞核較小，染色深，空缺骨陷窩數增多，透射電鏡下觀察到較多的骨細胞發生核固縮及骨細胞破裂成碎片，出現了股骨頭骨細胞的壞死。本課題組經過前期的實驗研究發現，股骨頭壞死大鼠股骨頭表面出現不平整，骨小梁結構出現紊亂，甚至斷裂現象，骨髓腔內脂肪細胞逐漸增大。由于骨壞死的確診標志是骨和骨髓死亡的組織學證據，所以此項指標被廣泛采用。

3.3 血生化測定

生化測定是對骨壞死的一種定量分析。學者在研究股骨頭壞死過程中，發現模型組動物涉及到脂代謝的各項血脂指標，包括總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度低蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血漿脂聯素含量與正常組動物有顯著性差異［31］。本課題組研究發現，股骨頭壞死動物的血清P含量均較正常組低、血清Ca含量則無顯著性差異，這可能與骨中鈣元素的融出有關。目前尚無對動物股骨頭壞死進行分期的統一標準，單獨依靠血生化的指標來評價股骨頭壞死模型復制成功與否是不全面，亦是不合理的，血生化指標的測定與組織形態學等其他指標結合的方法可作為參考，有助于判斷骨壞死的程度。

3.4 骨生物力學、骨Ca、P和骨密度

根據股骨頭壞死的綜合分期，在骨壞死早期，會出現輕微的骨質疏松，整個股骨頭壞死的發病期間經歷一個共同的骨質疏松的病理過程［1］。在股骨頭壞死動物模型中，利用骨生物力學中股骨彎曲載荷值、單位面積最大載荷量、彈性模量的測定［32］，可以顯示出壞死動物股骨脆性明顯增加，骨質明顯疏松。骨中的 Ca、P是骨礦物質的主要成分，股骨中Ca、P含量的高低是衡量骨質的一個非常重要標志。Ca、P含量低，說明骨質松脆，反應在骨生物力學上的各項評價指標更加明顯。骨密度，是骨質量的一個重要標志，反映骨質疏松程度。也曾有學者［33］研究發現股骨頭壞死的新西蘭大白兔骨密度比正常組明顯偏低，有非常顯著性的統計學差異。因此骨生物力學、骨 Ca、P及骨密度可作為股骨頭壞死動物模型建立成功的間接性評價指標。

3.5 股骨頭血管造影

王銳英等［34］認為血管造影可用于股骨頭壞死的早期診斷。股骨頭血管密度最低生理限度是多少，破壞或減少到何種程度可產生不可逆損害，可作為早期診斷股骨頭壞死的標準，尚有待進一步研究。

3.6 骨內壓

文獻早有報道骨內壓與骨壞死的密切關系，在股骨頭壞死的早期，骨內壓就有明顯的增高。曾有研究者采用測量骨內壓的方法，早期診斷股骨頭壞死，準確率高［35］。因此，骨內壓也被認為可以用作于間接判斷股骨頭壞死模型是否成功。

綜上所述，復制股骨頭壞死動物模型的方法很多，但是由于 ONFH的發病機理尚未完全明確，以及人和動物在生理解剖上存在的差異，現今還沒有一種公認的方法可以完全復制與人ONFH自然病理過程相一致的動物模型。近年來由于我國臨床上激素應用的增多，由于濫用激素引發的激素性股骨頭壞死發病率也逐年增高，應當提高對激素性股骨頭壞死的重視。目前國內外學者對于激素性股骨頭壞死動物模型的研究越來越多，但應用于造模的激素類型種類繁多，激素應用劑量也不盡相同，甚至有的學者在不同的造模動物之間采用體表面積換算的方法確定造模劑量。另外關于高劑量激素引起的動物死亡率問題沒有很多文獻報道，能夠使ONFH模型復制成功的最佳激素劑量亦尚無學者做過相關研究。另外在評價模型成立與否的評價指標方面，許多文獻研究中所選用的檢測指標也有待商榷，如血清鈣、血清磷含量，血脂等。在前期課題組的研究中發現血中的鈣、磷含量變化可能與骨頭中的鈣、磷元素的融出有關，而血脂的變化受多種因素的影響，不宜將其作為評價股骨頭壞死的特異性指標。因此還需進一步確定更為直觀、更能反映骨壞死本質的評價指標。綜上所述，對激素類型、劑量的考察以優化激素性股骨頭壞死動物模型的建立，以及形成合理、系統的評價體系應當是今后股骨頭壞死動物模型領域研究的重點內容。

［1］王義生.股骨頭缺血壞死［J］.中國矯形外科雜志，2005，13(4):310－312.

［2］劉尚禮，劉永軼.骨壞死基礎與臨床［M］.北京:人民軍醫出版社，2008.72－75.

［3］林詩富.不同治法預防激素性股骨頭壞死發生的比較研究［D］.貴陽:貴陽中醫學院骨傷科，2006:7－9.

［4］Conzemius MG，Brown TD，Zhang Y，et al.A new animal model of femoral head osteonecros is one that progresses to human like mechanical failure［J］.J O rthop Res，2002，20(2):303－309.

［5］馬信龍，孫智超，馬劍雄，等.改良型大鼠激素性股骨頭壞死模型建立和相關評價［J］.實用骨科雜志，2010，15(10):760－763.

［6］吳淮.補腎活血祛瘀法預防兔激素性股骨頭壞死的實驗研究［D］.廣州.廣州中醫藥大學藥學院中藥學，2010:20－22.

［7］蘇強，孫大勝，于秋良，等.不同劑量內毒素聯合激素建立免股骨頭缺血性壞死模型的影像學評估［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(11):2108－2111.

［8］王坤正，揚萬石，黃溶，等.兔激素性股骨頭缺血壞死早期細胞學電鏡觀察［J］.中華醫學雜志，1996，76(1):49－50.

［9］趙萬軍，肖魯偉，童培建，等.右歸飲、鹿馬片對激素誘導的兔股骨頭壞死的血漿雌二醇、睪酮的影響及療效觀察［J］.中醫正骨，2000，12(l):3 －4.

［10］Meng Fan，Jiang Peng，Ling Qin，et al.Experimental animal models of osteonecrosis［J］.Rheumatol Int(2011)31:983–994.

［11］Nishino M，Matsumoto T，Nakamura T，et al.Pathological and hemodynamic study in a new model of femoral head necrosis following traumatic dislocation［J］.Arch Orthop Trauma Surg，1997，116(5):259 －262.

［12］Lehner CE， AdamsWM， DubielzigRR， etal. Dysbaric osteonecrosis in divers and caisson workers:A animal model［J］.Clin Orthop Relat Res，1997，344:320 －332.

［13］SeilerJG， KregorPJ， Conard EU， etal. Posttraumatic osteonecrosis in a swine model.Correlation of blood cell flux，MRI and histology［J］.Acta Orthop Scand，1996，67(3):249－254.

［14］趙廣輝.聯合用藥對激素性股骨頭壞死干預作用的實驗研究［D］.鄭州:鄭州大學第一臨床醫學院外科學，2009:21－25.

［15］趙金東，呂松岑，薛 震，等.激素性股骨頭壞死動物模型的建立與評價［J］.中國骨腫瘤骨病，2007，6(4):220－225.

［16］黃俊.脂聯素促進大鼠激素性股骨頭壞死修復的實驗研究［D］.安徽:安徽醫科大學第一附屬醫院外科學，2009:1－4.

［17］孫克明，王和鳴，林久茂.復方巴戟天合劑對激素性股骨頭壞死大鼠血管內皮生長因子表達的影響［J］.中國實驗方劑學，2011，17(7):117－119.

［18］王偉，劉利英，王坤正，等.激素性股骨頭壞死模型的建立及其發病機理的探討［J］.西安交通大學學報，2007，28(5):5444－547.

［19］童培健，毛強，吳承亮，等.大鼠激素性股骨頭壞死骨代謝差異表達基因的實驗研究［J］.中華骨科雜志，2011，31(7):794－799.

［20］黃克勤，陳燕平，薛延，等.“承載丸”對股骨頭壞死大鼠細胞黏附分子基因的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(28):5495 －5498.

［21］趙金東，呂松岑，薛震，等.激素性股骨頭壞死動物模型的建立與評價［J］.中國骨腫瘤骨病，2007，6(4):220－225.

［22］Jones JP Jr.Fat embolism and osteonecrosis［J］.Orthop Clin North，1985 0ct，16(4):595 － 633.

［23］郭天明，朱天岳.酒精中毒致股骨頭壞死的動物模型［J］.汕頭大學醫學院學報，1999，12(2):16－20.

［24］齊振熙，喻燦明.酒精性股骨頭缺血壞死的動物模型研究［J］.福建中醫學院學報，2005，15(2):35－37.

［25］龔躍昆，彭吾訓，李世和，等.液氮冷凍建立犬股骨頭缺血壞死模型的實驗研究［J］.中國矯形外科雜志，2005，7(15):1171－1173.

［26］吳士良，徐嵐，周迎會，等.實驗性股骨頭缺血性壞死與修復對局部組織生化指標的影響［J］.上海實驗動物學，2004，1(1):26－29.

［27］李印良，徐莘香，張曉南，等.實驗性股骨頭壞死血運變化的初步觀察［J］.骨與關節損傷雜志，1995，10(2):95－97.

［28］彭吾訓，王蕾，鄧進，等.微波加熱制作股骨頭壞死模型:最適宜的溫度和時間篩選［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(17):3143－3146.

［29］楊明亮，羅先正，王正明.實驗性動物股骨頭壞死模型的制備及其病理生理機制［J］.中國骨傷，2000，13(4):207－208.

［30］賀西京，毛履真，王坤正，等.腎上腺糖皮質激素引起ONFH機制實驗研究［J］.中華骨科雜志，1992，12(6):40－44.

［31］帥波.非創傷性ONFH患者脂質代謝相關因子及血小板活化相關因子的臨床研究及中醫藥的治療作用［D］.湖北:華中科技大學中西醫結合臨床，2011:9－15.

［32］林婷.芪參健骨顆粒對股骨壞死模型大鼠的干預作用［D］.浙江:浙江中醫藥大學藥學院中藥學，2011:35－36.

［33］趙廣輝.聯合用藥對激素性股骨頭壞死干預作用的實驗研究［D］.鄭州:鄭州大學第一臨床醫學院外科學，2009:21－25.

［34］王銳英，毛小軍，張其亮，等.數字減影血管造影評價股骨頭壞死模型［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(23):4538－4541.

［35］李鵬翠，衛小春，牛金亮，等.骨內壓在激素誘導型股骨頭壞死病程發展中的價值［J］.生物骨科材料與臨床研究，2006，3(2):39－41.