轉細胞色素P450酶人源化小鼠及應用的研究進展

程一帆，馬 璟，嚴東明

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203)

細胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)是肝微粒體中存在的一種與CO結合并在450 nm處存在最大吸收的色素［1］。目前發(fā)現(xiàn)的CYP超過500種，共有57個同工酶分屬于18個家族和43個亞家族，它們參與介導了體內大部分化合物的代謝過程［2－4］。在新藥研發(fā)過程中必須在臨床前進行大量的動物藥效、藥代和毒理學研究，但由于CYP酶的種屬間差異性，導致動物實驗數(shù)據(jù)外推至人存在不確定性。近年來，利用基因工程和分子生物學技術設計出的轉人CYP的人源化小鼠模型為藥物的研發(fā)提供了極大的便利，轉CYP人源化小鼠(CYP humanized mouse)是將人CYP相關基因或者人外源性激活的核受體直接導入或者替代小鼠相關等位基因，制備出可以表達人CYP的轉基因小鼠模型。本文綜述了轉CYP人源化小鼠及應用的研究進展。

1 傳統(tǒng)模型及轉CYP人源化小鼠模型的優(yōu)勢

CYP酶系，尤其是CYP1-3家族參與了超過75%的臨床用藥、前致癌物的I相代謝反應以及大量日常膳食和外源化合物的生物轉化調控［5－7］。近期對CYP一些酶結構和功能的研究報道，發(fā)現(xiàn)酶上特定結構位點能與某些環(huán)境因子、污染物產生較強的結合，促進了外源化合物的體內轉化［8］。因此，針對CYP的研究，對研究化學物質的生物轉化和體內毒性有著極其重要的臨床意義和科研價值。

目前研究藥物代謝的體外模型有肝微粒體模型、基因重組酶系模型、肝細胞模型、肝-腸灌流模型和肝組織切片模型等。對于體內代謝轉化率低、毒性大及缺乏靈敏檢測手段的藥物來說，體外代謝研究已成為良好的研究手段。但是體外實驗脫離體內微環(huán)境的支持，并且模型在構建時難免會破壞細胞、器官、組織的完整結構或者使某些蛋白丟失，導致實驗結果與體內真實代謝情況具有差異性。此外，體外模型也不方便進行多個代謝產物的同時分析［9］。

為了模擬生物體的整體效果，一般還需要進行體內代謝實驗。相較于體外實驗，體內實驗對靶標物質及其代謝產物的檢測具有一定的難度。但是體內代謝模型可以綜合考慮各種體內因素對藥物的影響，能夠真實全面地反映藥物代謝的體內整體特征。嚙齒類動物已成為體內實驗動物模型的較優(yōu)選擇［10－12］。然而，一些實驗數(shù)據(jù)表明，嚙齒類動物體內CYP酶系的催化活性與人相比有顯著的差異性，因此特定化合物的代謝與人不同。以人CYP2D6和鼠Cyp2d亞家族以及人CYP3A4和鼠Cyp3a亞家族的活性差異尤為顯著。大、小鼠和人CYP酶在基因復雜性，基因拷貝量以及它們在組織中的表達分布等多方面有種屬差異性［13］。Krausova等［14］研究表明，對于調控CYP基因表達的特定核受體也存在著種屬差異，這也是導致大、小鼠和人對外源性物質代謝調控差異性的重要原因。因此，采用普通大、小鼠模型預測外源性物質(如藥物)在人體內代謝和相互作用的結果并不理想。

隨著基因工程和分子生物學技術的蓬勃發(fā)展，以及日漸成熟的轉基因和基因融合技術，人們已可以培育出帶有靶標基因的轉基因小鼠，在小鼠上表達人類基因，就構建出了人源化小鼠模型(humanized mouse model)。人源化小鼠模型通常帶有功能性的人類基因、細胞或組織，因此可以模擬人體內環(huán)境。通過構建人源化小鼠模型可以解決動物模型實驗數(shù)據(jù)外推至人體時的不確定性問題。近些年來，人源化小鼠模型逐漸被用做人類疾病研究穩(wěn)定的活體替代模型，有些品系已經應用多年，且沒有出現(xiàn)轉基因缺失的現(xiàn)象，因而成為研究化合物在人體內作用規(guī)律的重要工具。人源化小鼠模型在研究CYP的內源性底物、尋找核受體的配體、藥物作用新靶點及疾病相關蛋白［15］以及確定酶和核受體介導的生理藥理過程等方面也有重要的應用。

2 人源化小鼠模型的研究進展

1974年Jaenisch等［16］首次報道，通過向小鼠囊胚注入猴(simian)病毒40(SV40)后，40%子代小鼠體內檢測到SV40的表達產物，證明了外源DNA整合入胚胎細胞中的可能性。1980年Gordon等［17］通過原核期胚胎顯微注射方法制備出了轉基因小鼠，開辟了轉基因動物研究領域的新紀元。1982年Palmiter等［18］報道，將5'調控區(qū)缺失后的大鼠生長激素基因與小鼠金屬硫蛋白I基因啟動子相連接，培育出“巨型小鼠”，在生命科學領域引起了一場不小的轟動。1985年Smithies等［19］首次證實了哺乳動物細胞中同源重組的存在，奠定了基因敲除的理論基礎。1987年Thomas等［20］根據(jù)同源重組原理，實現(xiàn)了ES細胞引入外源基因的定點整合，這一技術稱為“基因打靶”(gene targeting)。基因打靶技術的問世大大提高了構建轉基因動物的成功率和準確率。1993年，Gu等［21］應用Cre/loxP重組酶轉染技術實現(xiàn)了外源基因的條件性表達規(guī)避了基因打靶可能會導致胚胎死亡的一些不足。目前在轉基因小鼠的構建方面比較常用的方法依舊是基因打靶以及利用重組酶轉染技術的條件性打靶方式或者基于二者為基礎的一些新技術。

轉人基因小鼠模型在諸多領域均有應用，其中在研究CYP功能調控，進一步揭示藥物代謝毒性反應等方面近15年來也取得了長足的進展。2001年Corchero等［22］成功制備了表達人類CYP2D6的轉基因小鼠模型用于藥理和毒理的臨床前研究，成功解決了由于異喹胍羥化酶(CYP2D6)種屬間顯著差異所引起的其他動物模型用于毒理評價的缺陷。2003年，Granvil等［23］將包含人 CYP3A4和 CYP3A7基因的BAC(細菌人工染色體)注入敲除掉等位基因的小鼠體內，制備了人源化轉基因小鼠模型。2005年，Cheung等［24］用同原理的方法制備了CYP2E1人源化小鼠研究了對乙酰氨基酚的肝毒性。2008年，F(xiàn)elmlee等［25］通過將分別攜有CYP2D6和CYP3A4的小鼠進行交配，成功構建了轉CYP3A4/CYP2D6的雙轉基因小鼠，并研究發(fā)現(xiàn)在不同發(fā)育階段和不同性別的個體中CYP會受到多種多樣的外源性因素影響。綜上所述，克服了種屬間差異性的人源化小鼠模型是研究CYP的功能和藥物在人體內代謝規(guī)律的最優(yōu)選擇。

3 轉CYP人源化小鼠的分類

轉人CYP人源化小鼠根據(jù)轉入酶的不同進行分類，目前主要有轉人CYP1A亞家族、CYP2D6、CYP3A亞家族、孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)/CYP3A4，CYP4F2和CYP2E1等人源化小鼠模型。

3.1 轉CYP1A亞家族人源化小鼠

CYP1A亞家族包含了CYP1A1和CYP1A2兩種酶。外源性物質經CYP1A代謝產物包括多環(huán)芳香族碳氫化合物(PAH)、雜環(huán)胺和雜環(huán)芳香胺等多種化學致癌物［26］。

利用BAC技術將編碼人CYP1A1和CYP1A2的基因轉入鼠源CYP1A1和CYP1A2敲除的小鼠中，形成相應的人源化小鼠。通過對CYP1A的mRNA拷貝數(shù)、蛋白表達水平以及相關酶活性等參數(shù)的檢測結果顯示，人源化小鼠肝內CYP1A1和CYP1A2表達情況與人體內表達情況類似。對人源化小鼠和野生型小鼠給予CYP1A1特異性底物〔苯并(a)芘和乙氧基試鹵靈〕和CYP1A2特異性底物(乙酰苯胺和甲氧基異酚二唑)代謝后檢測得到的實驗結果顯示，人源化小鼠肝內的CYP1A1催化苯并(a)芘的羥化效率比野生鼠源CYP1a1的催化效率低97.4%到99.4%，且7-乙氧基異吩噁唑酮脫乙基酶活性也低約98.1%。與此不同的是，兩者表達的CYP1A2的功能幾乎相同。綜上所述，鼠和人的CYP1A底物特異性變化比較大且這些變化與CYP1A的表達水平或蛋白濃度無關，但只要注意這些變化，轉CYP1A人源化小鼠依舊可以作為安全性評價、毒理學、藥理學和一些疾病治療的有效工具［27－28］。

3.2 轉CYP2D6人源化小鼠

人CYP2D6酶參與了超過25%市售藥物的體內代謝。然而CYP2D6酶的種屬差異性比較大，大鼠和小鼠至少含有5種CYP2D基因，但無一能編碼與人相同的CYP2D6活性。因此，缺乏動物模型研究CYP2D6多態(tài)性，而人源化CYP2D6小鼠模型可對弱、強代謝型不同表型的研究提供手段。這使得應用普通動物模型很難預測CYP2D6介導的藥物代謝［29－31］。

在人源化CYP2D6(humanized CYP2D6，hCYP2D6)小鼠，野生型小鼠和CYP2D敲除小鼠中通過Western蛋白質印跡法進行檢測，發(fā)現(xiàn)在hCYP2D6小鼠體內CYP2D6在肝，十二指腸和空腸均大量表達;回腸微粒體檢測結果表明，相較于小腸的其他部位其CYP2D6的表達略微降低。此外，在腎微粒體中也檢測出了CYP2D6的表達。而在野生型小鼠和CYP2D敲除小鼠提取的組織微粒體中均無法檢測出CYP2D6的表達。與之相反的是相應的鼠源CYP2D基因表達產物在野生型小鼠體內大量表達而在hCYP2D6和CYP2D敲除小鼠表達甚少。野生型和hCYP2D6小鼠體內CYP2D6底物的藥代學研究中，分別檢測野生型和hCYP2D6小鼠在給予奎尼丁前后丁呋洛爾的代謝變化和異喹胍在兩者體內的代謝情況。結果顯示，野生型小鼠體內丁呋洛爾的消除較快，這與其1'-羥化酶活性較高的體外實驗結果一致。聯(lián)合給予奎尼丁后，hCYP2D6體內丁呋洛爾暴露量增加，而野生型小鼠體內無明顯變化，這與體外實驗結果一致，驗證了奎尼丁是人CYP2D6的選擇性抑制劑。野生型小鼠與hCYP2D6小鼠體內異喹胍代謝實驗結果顯示，野生型小鼠體內異喹胍的暴露量很高，這與hCYP2D6小鼠體內 4'-羥化酶活性較高的實驗結果一致。因此，轉CYP2D6人源化小鼠是檢測CYP2D6選擇性抑制劑和特異性底物的良好工具［29］。應用該人源化小鼠模型對于揭示該酶介導的體內藥物代謝和藥物相互作用中個體差異的原因，及在新藥研發(fā)和毒性評價等方面均具有重要的價值。

3.3 轉CYP3A亞家族人源化小鼠

人類第7號染色體上有編碼CYP3A家族的基因，CYP3A亞家族包含了4個同源基因(CYP3A4，CYP3A5，CYP3A7和CYP3A43)。小鼠CYP3A亞家族包含了7個編碼基因，但是與人的編碼基因并沒有同源性。說明人的CYP3A中的各個同工酶來自于同一祖先。通過最新的質譜陽 離 子 檢 測 發(fā) 現(xiàn)［32］，CYP3A4，CYP3A5，CYP3A7 和CYP3A43結構相同的部分達到85.4%。CYP3A4是P450酶系中在小腸中表達的主要代謝酶，參與了眾多口服藥物的首過代謝，其表達水平與在肝臟中表達水平無相關性。人CYP3A4與小鼠CYP3A家族之間存在著顯著的種屬差異性，普通小鼠不能很好的預測由CYP3A4介導的藥物代謝。

Granvil等［23］利用 BAC克隆技術，將一個上游帶有PXR-位點的全人CYP3A4基因導入到小鼠體內表達，生成人源化小鼠。檢測小鼠的腸微粒體發(fā)現(xiàn)，人源化小鼠小腸較野生型小鼠高度表達CYP3A4。口服給予CYP3A4探針藥咪達唑侖，顯示人源化CYP3A4小鼠對其的代謝清除率遠高于無CYP3A4的野生型小鼠，而靜脈注射給予此藥在小腸內代謝清除率無明顯差異。同時口服給予CYP3A4抑制劑酮康唑，發(fā)現(xiàn)咪達唑侖的清除率降低，驗證了咪達唑侖和酮康唑間潛在的藥物相互作用。van Waterschoot等［33］設計實驗將人CYP3A4基因轉入CYP3A敲除的小鼠生成轉CYP3A4人源化小鼠，應用三唑侖作為探針藥進行檢測。與結構類似物咪達唑侖相比，三唑侖較其他鼠源CYP酶來說是更好的CYP3A特異性底物。通過檢測小鼠體內三唑侖代謝產物1'-OH-三唑侖和4-OH-三唑侖的濃度來評估野生型小鼠、CYP3A敲除［CYP3A(－/－)］小鼠、轉人 CYP3A4基因(CYP3A4-Tg)小鼠體內代謝活性情況。提取相應的小鼠肝微粒體進行檢測，野生型小鼠微粒體中檢測出三唑侖代謝產物為1'-OH和4-OH三唑侖，其代謝反應符合米氏動力學。三唑侖低濃度時，主要產物為1'-OH三唑侖，隨著三唑侖濃度升高，主要代謝產物轉為4-OH三唑侖。在CYP3A(－/－)小鼠肝微粒體中檢測結果顯示，三唑侖的代謝程度大大降低，幾乎無法代謝。與野生型小鼠相比1'-OH三唑侖濃度降低了97.5%而4-OH三唑侖濃度降低92.8%。在CYP3A4-Tg小鼠體內，僅在肝組織處表達CYP3A4，與野生型相比展現(xiàn)出不同的藥代動力學輪廓。CYP3A4與三唑侖的親和力比鼠CYP3A的小80.0%，但其代謝三唑侖產生1'-OH三唑侖的最大反應速率與鼠源CYP3A相比提高了3倍。因此，在CYP3A4-Tg小鼠中生成1'-OH-三唑侖的固有清除率與WT小鼠相比僅降低了38.3%，而生成4-OH-三唑侖代謝反應的固有清除率還增加了2.1倍。這些實驗結果與人肝微粒體體外實驗結果很相似，且藥代動力學參數(shù)也處于同一水平［33］。

綜上所述，利用轉人CYP3A4人源化小鼠研究CYP3A4介導的藥物代謝，可以得到與人體代謝相似的實驗數(shù)據(jù)，為研究藥物在體內的代謝，評估藥物間的相互作用，預測藥物的潛在危險提供了寶貴的方法。

3.4 轉PXR/CYP3A4雙轉基因人源化小鼠

核受體PXR和構雄烷受體(contitutive androstane receptor，CAR)由DNA結合域和配體結合域組成，其配體結合域可以與眾多藥物配體(如巴比妥類、利福平、他汀類藥物、鈣拮抗劑、咪達唑侖)相結合。經配體活化的PXR發(fā)生構象改變后，作用于CYP3A4基因啟動子區(qū)的DNA應答元件誘導其轉錄表達［34－36］。PXR與不同配體的親和力具有種屬差異性。例如利福平作為典型的PXR配體而不能活化大鼠PXR。這種種屬差異限制了動物模型在藥物代謝研究領域的應用。構建PXR-CYP3A4的人源化小鼠可以使得更多藥物在動物體內的代謝測試更準確，促進藥物臨床前安全性預測［37］。

MA等［38］設計出一種雙轉基因人源化小鼠(TgCYP3A4/hPXR)。用這種雙轉基因的小鼠模型進行研究，使得人體內PXR-CYP3A4介導的利福平-蛋白酶抑制劑間的相互作用得以重現(xiàn)，利福平預處理的TgCYP3A4/hPXR小鼠的肝微粒體中，安普那韋，奈非那韋和沙奎那韋的代謝穩(wěn)定性分別下降了52%，53%和99%。經利福平預處理的小鼠體內實驗結果發(fā)現(xiàn)，血清安普那韋的藥時曲線下面積降低80%［38］。這些結果表明，這種雙轉基因小鼠可以用于體內CYP3A4轉錄和功能表達的研究。

PXR/CYP3A4人源化小鼠有著轉人PXR或轉人CYP3A4小鼠無法比擬的優(yōu)勢，其在藥代動力學、檢測PXR激動劑和抑制劑、在抑制炎癥和對人類疾病的調控等研究領域中的應用取得了良好的效果［39］。

3.5 其他人源化小鼠

CYP4F2，CYP4A11和CYP4F3B被認為是代謝花生四烯酸的主要酶類。花生四烯酸可以被環(huán)氧合酶以及脂氧合酶分解成前列腺素，前列環(huán)素，血栓素以及白三烯類，對心血管疾病的防治有著重要的作用。有報道稱，轉CYP4F2基因在外源啟動子的激動下，可以增加花生四烯酸的含量［40］。劉曉亮等［41］將 pKAP-CYP4F2利用顯微注射技術導入FVB/N小鼠產生轉基因小鼠。通過Western蛋白質印跡法，在所有腎部樣品中檢測出CYP4F2的表達，從而驗證了轉CYP4F2小鼠模型的成功構建。對人源化小鼠體內花生四烯酸進行研究表明其與體內高血壓的形成有關。過量表達CYP4F2可以造成花生四烯酸產量增加從而促進高血壓的生成，因此，轉CYP4F2小鼠模型的構建對于研究高血壓的形成和治療將會很有意義。

Lu等［42］設計應用野生型小鼠、CYP2E1敲除小鼠以及轉CYP2E1人源化小鼠研究乙醇誘發(fā)的肝損傷。在給予高濃度乙醇飼料連續(xù)飼養(yǎng)之后，他們發(fā)現(xiàn)脂肪肝和氧化應激反應存在于野生型小鼠和人源化CYP2E1小鼠中并且在人源化小鼠中肝損傷更為顯著。CYP2E1敲除小鼠體內這些現(xiàn)象減弱。利用這種模型，可以揭示過度飲酒造成的損害，進一步揭示乙醇對肝損傷的機制。

4 展望

轉CYP人源化小鼠模型的研究目前主要集中在構建轉CYP1～3家族的人源化小鼠。利用這些模型進行藥代動力學和藥物安全性評價可以得到比普通小鼠更真實可靠的外推數(shù)據(jù)。近些年國內外已有公司構建了人源化CYP2D6小鼠模型、人源化 CYP3A4/3A7小鼠模型、人源化 Liver CYP3A4小鼠模型和人源化PXR-CAR-CYP3A4/CYP3A7小鼠模型等產品進入商業(yè)市場。這些商業(yè)化供應的人源化小鼠廣泛應用于體內代謝酶的作用機制研究和新藥研發(fā)的相關過程。近年來隨著分子生物學的深入研究，一些實驗室構建了新靶點的CYP人源化小鼠，用來研究代謝酶參與的癌癥發(fā)病機制和外源化合物引起的毒性反應。這些將為探索生命科學的奧秘、揭示疾病和健康的關系提供強有力的支持。

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