納米炭和亞甲藍作為肝癌淋巴引流示蹤劑的實驗研究

宋偉峰 羅淑媛

中山大學附屬第三醫院，廣東 廣州 510630

納米炭和亞甲藍作為肝癌淋巴引流示蹤劑的實驗研究

宋偉峰 羅淑媛

中山大學附屬第三醫院，廣東 廣州 510630

目的：探討納米炭注射液和亞甲藍注射液腫瘤淋巴結示蹤對肝癌根治手術的應用價值。方法：選用兔VX2腫瘤細胞株，采用開腹腹腔種植法制作兔肝癌模型。將20只新西蘭大白兔隨機分為亞甲藍組和納米炭組，各10只。兩組均切除兔肝癌，清掃局部淋巴結，觀察肝臟的周圍淋巴結轉移癌的個數、兩種術中示蹤劑對淋巴結轉移癌的示蹤效果。結果：淋巴結染色時間納米炭組 （100.50± 29.92）s，亞甲藍組（11.20±4.18）s，有統計學意義（P＜0.01）。淋巴結褪色時間納米炭組（2.22±0.74）h，亞甲藍組（1.63±0.54）h，無統計學意義（P＞0.05）；準確性亞甲藍組87.5%（35／40），納米炭組87.2%（34／39），無統計學意義（P＞0.05）。結論：兔肝癌模型行肝癌切除和淋巴結清掃手術中應用納米炭注射液和亞甲藍注射液對肝癌及淋巴引流具有明顯的示蹤作用，降低手術清掃的復雜性和危險性，避免傳統手術中淋巴結清掃過程的盲目性，能有效降低術后轉移淋巴結的殘留，能更加安全、便利、快速、徹底地清掃淋巴結。

納米炭注射液；亞甲藍注射液；淋巴示蹤；淋巴結清掃；肝癌模型

原發性肝癌是危害人類健康的重大惡性腫瘤之一，在與腫瘤相關死亡原因中位列第三［1］。肝癌治療除肝移植外，仍以外科手術切除為首選治療策略，但肝癌手術治療后復發率高，其中重要因素是淋巴結轉移導致肝癌細胞轉移［2］。肝癌的示蹤技術的應用將會提升肝癌患者的綜合治療水平，降低肝癌轉移率和復發率。本文通過模擬人體肝癌治療手術，探討納米炭和亞甲藍注射液對兔肝癌淋巴引流示蹤的效果，分析其應用于臨床的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 VX2腫瘤細胞株由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物及模型的建立 取日本健康大白兔22只，雌雄不拘，3～4月齡，體重2.5～3.0kg。實驗前分籠飼養1周。取健康日本大白兔2只，后腿肌肉中注射細胞計數1× 106／m l的VX2細胞懸液1.0ml，14天后，注射部位形成可觸及直徑約2cm－2.5cm的類球型腫塊，即制成了荷瘤兔。切取腫瘤，剪成1mm×1mm×1mm大小瘤塊待用。剩余20只大白兔稱重，隨機分為兩組，一組為納米炭組，一組為亞甲藍組。麻醉后，取上腹正中切口進腹，將有齒鑷合并起來斜行穿刺肝左葉較厚處，使成一個盲道。夾取2枚瘤塊，塞入此盲道最深處，關腹。術后21d兔肝左葉內形成直徑約0.8－1cm的類球型腫塊。

1.2.2 肝癌淋巴結示蹤法 納米炭組手術步驟：麻醉后，取原切口進腹，用1ml注射器取0.1m l納米炭注射液于肝臟左葉腫瘤周圍2～3點緩慢注射，10s內注射完畢。

亞甲藍組手術步驟：麻醉后，取原切口進腹，用1ml注射器取0.1m l亞甲藍注射液于肝臟左葉腫瘤周圍2～3點緩慢注射，10s內注射完畢。

兩組均記錄肝臟周圍淋巴結數量、位置，淋巴結明顯褪色時間。

1.2.3 組織病理學檢查 觀察肝癌標本有無包膜、包膜是否完整，有無衛星灶、門靜脈癌栓，腫瘤切緣1mm范圍內是否有腫瘤細胞。淋巴結標本是否有轉移。

1.3 數據統計學處理 數據采用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。經計量資料正態分布和方差齊性檢驗后，均數±標準差 （±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 染料褪色時間 實驗時每隔5min肉眼觀察，記錄染料從第1枚淋巴結染色到最后1枚完全褪色時間。結果發現在淋巴結染色時間上，納米炭組為（100.50±29.92）秒，亞甲藍組為（11.20±4.18）秒，有統計學意義（P＝0.000）。淋巴結褪色時間的對比，納米炭組為（2.22± 0.74）h，亞甲藍組為（1.63±0.54）h，納米炭組較亞甲藍組時間長，但無統計學意義（P＝0.058）。其它指標的對比均無統計學意義。

2.2 淋巴結染色枚數 納米炭組共檢出淋巴結39枚，其中染色淋巴結17枚，平均檢出個數（1.70±0.95）枚，未染色22枚，病理證實存在淋巴結癌轉移為16枚，無轉移為23枚。染色淋巴結有癌轉移14枚，染色淋巴結無癌轉移3枚，淋巴結無染色有癌轉移2枚，淋巴結無染色也無癌轉移20枚，準確性87.2%（34／39）。

2.3 亞甲藍組與納米炭組的肝癌觀察 觀察肝癌大體標本，可見兩組腫瘤切面均為灰白色、魚肉狀，質地硬，周圍正常肝組織邊界清楚，無明顯包膜。

2.4 淋巴結清掃標本結果的觀察 本實驗在兩組實驗動物中，兔肝臟周圍最多發現6枚淋巴結，最少為2枚。染色淋巴結的發現部位以肝胃韌帶內的肝總動脈旁、胃左動脈旁和肝十二指腸韌帶內的淋巴結多見。

3 討論

在中國除了肝移植外，對肝癌采用外科手術切除是目前首選的治療方法。但肝癌微轉移灶難于發現，局部轉移淋巴結清除率低［3］。這將會導致肝癌根治性切除術后的復發。區域淋巴結轉移情況是大多數實體腫瘤分期的重要組成部分，也是預后的重要指標。淋巴結清掃是實體瘤根治術中重要的步驟之一，但其在肝癌患者中的作用仍不明確，以往分析影響肝癌預后因素的研究中極少考慮淋巴結轉移因素，對肝癌局部淋巴結轉移的研究較少［4］，究其原因是當前沒有前瞻性的隨機對照試驗結果來說明系統性清掃淋巴結對肝癌病人是有益的，所以目前尚未對切除原發肝癌的同時，是否進行淋巴結的清掃未能達成共識［5］。

本實驗在肝癌外科手術開始時，將經驗性、盲目性的肝癌切除和淋巴結清掃手術變為在直視條件下病灶被示蹤的 “有的放矢”的切除過程，力爭達到降低肝癌手術的癌灶殘留和轉移淋巴結的遺漏，最終達到降低肝癌的復發，延長患者生存期的目的。

納米炭注射液內主要成分為納米炭顆粒［7］，通常以平均粒徑150nm的團粒形式存在，可被巨噬細胞迅速吞噬，毛細淋巴管內皮細胞的疊瓦狀排列結構，細胞間隙達100－500 nm，基底膜不完整，加上組織液和淋巴液的壓力差，淋巴液的向心流動，使得納米炭粒能迅速進入淋巴管，滯留并集聚于相應淋巴組織使其出現可視性黑染［8］。將這種特性應用到肝癌切除術中直視下尋找淋巴結的操作。綜上所述，應用納米炭和亞甲藍術中示蹤技術，將復雜、易發生醫源性損傷的肝臟周圍淋巴結清掃手術，變為可視性、安全、穩妥、有效的操作過程，兩種染料各具缺優點，染色時間上存在差異，而褪色時間相當，兩種染料在肝癌的淋巴結顯像效果相當。

［1］王英，李文濤.肝癌干細胞與肝癌的研究進展 ［J］.中國癌癥雜志，2011，21（9）：735－738.

［2］欽倫秀，葉青海，湯釗猷.肝癌轉移復發的分子機制與預測：從組學研究到臨床應用.第十三屆中國科協年會第18分會場——癌癥流行趨勢和防控策略研究研討會，2011：67－70.

［3］舒宏，康曉楠，劉銀坤.肝癌轉移、復發預測的蛋白質分子標志物 ［J］.世界華人消化雜志，2010，18（13）：1350－1355.

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1007－8517（2013）13－0074－02

2013.05.07）