轉基因常見檢測技術與蛋白質組學的應用

方獻平，馬華升，余 紅，金 亮，劉 輝，張 樂，翁麗萍，來文國

(1.浙江省杭州市農業科學研究院，浙江杭州 310024;2.浙江大學，浙江杭州 310058)

自1996年轉基因作物商業化種植以來，在全球發展迅猛，產生了巨大的經濟效益。根據農業生物技術應用國際服務組織 (ISAAA)2007年度報告，轉基因作物種植面積從1996年的170萬hm2到2007年的1.143億hm2，增長了60倍。轉基因作物種植的國家達到23個，另有29個國家同意轉基因作物作為食品和飼料進口，或進行環境釋放試驗。目前共有23種轉基因作物的1 247個項目獲得615項批準。2006年全球轉基因作物種植者的凈收益是70億美元，1996－2006年間的累計收益達340億美元。在我國，目前批準商業化種植的轉基因作物有抗蟲棉、延遲成熟番茄、抗病毒番茄、抗病毒甜椒和線椒、改變花色的矮牽牛以及抗病毒木瓜等，其中抗蟲棉的種植面積最大。2006年我國轉基因作物種植面積達350萬hm2，是轉基因作物種植第6大國。

然而轉基因生物在給人類帶來諸多好處的同時，其安全性問題一直備受爭議。1998年，英國Rowentt研究所的Pusztai博士在電視臺發表講話，聲稱大鼠食用轉雪花蓮凝集素基因的馬鈴薯后，體重和器官重量減輕，免疫系統受到破壞。此后，又相繼發生了斑碟事件、加拿大超級雜草事件、墨西哥玉米事件、中國Bt抗蟲棉事件、轉基因大豆中多余未知的DNA等一系列重大的轉基因事件，引發了國際社會對轉基因作物及其產品對人類健康和生態環境影響的激烈爭論和廣泛關注。盡管后來的調查證明，這些事件中所得結論缺乏科學依據，而且目前批準商業化的轉基因作物及其產品尚未發現有安全性問題，但轉基因作物的應用畢竟只有短短的10多年，其潛在的風險和非預期效應難免讓人擔憂。

為了加強對轉基因作物的管理，世界各國紛紛制定了相應的法律法規。1998年6月歐盟規定，對農作物的種子、食品和飼料貼示標簽，必須標示其是否含有轉基因成分;隨后又規定，當轉基因成分超過1%時，實行強制性標識制度;2002年歐盟執行新的轉基因產品管理法規，要求對轉基因產品從生產、運輸、保存、銷售進行全程的跟蹤、檢測。到目前為止，已有包括歐盟國家在內的40多個國家和地區制定了相關的法律和法規，要求對轉基因生物及其產品 (包括食品和飼料)進行標識管理。在我國，2001年5月國務院頒布了《農業轉基因生物安全管理條例》，將研究試驗、生產、加工、經營和進出口各環節都納入了農業轉基因生物安全管理的范疇。2002年以來，農業部先后發布了與之配套的4個管理辦法，即《農業轉基因生物安全評價管理辦法》《農業轉基因生物進口安全管理辦法》《農業轉基因生物標識管理辦法》和《農業轉基因生物加工審批辦法》。這些法律、法規的實施標志著中國農業轉基因生物安全管理進入法制化、規范化的管理軌道。在我國境內從事農業轉基因生物的研究、試驗、生產、加工、經營和進口、出口活動都須遵守這些條例，這是符合國際慣例，是非常必要的。在杭州市，農業部也專門批準設立了農業部農產品及轉基因產品質量安全監督檢驗測試杭州分中心。

轉基因生物安全問題需要進行轉基因生物安全評價，而轉基因生物檢測技術是安全評價的關鍵之一。因此，研究轉基因農產品檢測的關鍵技術，探索轉基因生物計量和全程溯源技術，建立轉基因農產品安全檢測技術體系，成為亟待解決的關鍵問題。本文針對目前常用的轉基因安全檢測技術及蛋白質組學技術在轉基因作物檢測中的應用前景進行綜述。

1 轉基因檢測的常用方法

目前國際社會對轉基因食品的檢測技術主要有兩類，即檢測轉基因成分核酸序列和檢測轉基因成分編碼的蛋白質。

1.1 基于核酸的檢測方法

針對外源目的DNA的檢測技術主要有3種。

1.1.1 分子雜交技術

利用 Southern Blot法，不僅能夠檢測外源DNA，而且能夠確定外源基因在植物基因組中的排列情況和拷貝數等;但Southern blot是將目的DNA進行原位雜交，沒有擴增、放大的過程，所以檢測的靈敏度要比PCR檢測方法低得多。

1.1.2 PCR方法

包括定性PCR方法、復合PCR方法、競爭性定量PCR方法和熒光定量PCR方法。轉基因產品PCR檢測方法的主要依據是特異性擴增外源基因片段，對于同一待測樣品，選擇不同的特異性目的基因片段得到的PCR檢測結果可能不太一致。因此建立轉基因產品PCR檢測方法時，需充分考慮特異性擴增的目的片段。PCR引物的設計和反應條件的優化、如何處理每對引物反應效率不一致性、檢測通量不高等都是檢測中需要解決的問題。

1.1.3 基因芯片技術

該方法正處于發展階段。由于需要昂貴的檢測雜交微弱信號的裝置，需要具有對雜交信號及相關信息、數據的大規模處理和分析能力，目前應用于轉基因檢測還比較少。

1.2 基于蛋白質的檢測方法

以抗原、抗體為基礎的免疫學方法可通過檢測外源基因表達的蛋白來定性、定量檢測轉基因產品。建立這些檢測方法通常需要將外源結構基因表達的蛋白產物制備特異性的單克隆或多克隆抗體，建立Western Blot、ELISA法和試紙條法等。

Western Blot方法特異性高，可用于定性檢測，尤其適用不溶性蛋白的分析，其檢測靈敏度在種子檢測中可達0.25%，在烘烤的食品中為1%。但該方法不能進行定量分析，操作繁瑣且費用較高，不適合高通量檢測。

ELISA方法主要用于定性檢測轉基因產品，借助于酶標儀，可根據已知標準物質的一系列濃度梯度與吸光度值制作的標準曲線，確定檢測樣品中目的蛋白的含量。由于缺乏轉基因產品的內源蛋白作為對照，ELISA檢測方法不能精確定量測定轉基因含量，只能達到半定量測定的水平。

免疫試紙條檢測方法是根據抗原、抗體特異性結合原理建立的方法，以硝化纖維代替聚苯乙烯反應板為固相載體，將固定有抗體的試紙條或固相帶浸入到蛋白提取液中，如果樣品中含有外源目的蛋白，試紙條上抗體可與目的蛋白發生反應，產生顏色變化。該方法操作簡單、易于操作，一般5～10 min可獲得檢測結果。但一種免疫試紙條只能檢測一種目的蛋白質，不能區分具體的轉基因品系，且檢測靈敏度較低，為0.15%。

2 轉基因檢測技術中的存在問題

目前常用的兩類轉基因生物檢測方法各自存在假陽性結果多、標準物研發滯后、靈敏度和準確度低、操作繁瑣、效率和通量低、目標蛋白質和抗體制備難等問題，而大樣本量和多目標基因的轉基因農產品的快速、準確、靈敏的檢測，是分析鑒定轉基因農產品和了解轉基因農產品外源基因的功能及影響的基礎，是提高新品種培育效率和構筑轉基因農產品安全性的關鍵步驟，目前國際上還沒有一種方法能很好地解決此問題。因此，有必要建立操作簡單、高效快捷和精準靈敏的新的轉基因生物檢測分析方法，以適應當前研究和生產領域的緊迫需求。蛋白質組學技術在轉基因檢測方法中的應用無疑具有積極意義。

3 蛋白質組學技術在轉基因檢測中的應用前景

由于許多轉基因作物表現出一定的與外源基因相關的蛋白質變化性狀，即多數外源基因的表達或調控產物是蛋白質，其表達或調控可能導致蛋白質種類和含量的改變。因而在蛋白質水平上對轉基因生物進行檢測和研究顯得尤為重要。蛋白質是幾乎所有生物學過程的功能單位，而蛋白質組(Proteome)是指一個細胞在特定時間和特定環境條件下所有蛋白質的表達。隨著蛋白質組學技術的日益發展和完善，蛋白質組學方法在包括植物生長、病理、農產品質量安全等許多研究領域都得到廣泛應用，并取得一系列令人矚目的研究成果。轉基因農產品主要是由水和蛋白質組成，因此對其蛋白質組進行分析，就能提供海量的信息，展示參與決定轉基因農產品區別于非轉基因農產品之間的真正起表達作用的蛋白結構和功能。因此，以蛋白質組學技術平臺和最新技術方法為依托，構建新的基于蛋白質的轉基因生物檢測評價技術體系，是解決當前轉基因生物新品種培育和安全性評估監測所面臨的檢測和研究技術滯后的重要手段之一。

蛋白質組學技術方法是一類以先進儀器設備為支撐，對生物體蛋白質的組成與變化進行高通量、高靈敏度、高分辨率分析研究的新技術方法，大致可分為電泳、色譜和質譜鑒定技術3種。

雙向電泳 (two-dimensional electrophoresis，2-DE)技術是目前使用最廣泛的一種高分辨率的分離技術。2-DE技術是利用蛋白質的等電點差異，先完成第一向電泳分離，隨后利用分子量差異進行二維電泳分離，完成蛋白質樣品的高分辨率雙向凝膠電泳分離后，比較分析不同樣品的蛋白質種類和含量，并將分離到的蛋白質酶解成肽片段后進行質譜鑒定。2-DE儀器和方法較成熟，雖然操作煩瑣耗時，且消耗品較貴，但利用2-DE技術，結合質譜鑒定技術，可望避免傳統的轉基因生物檢測技術無法系統了解蛋白質變化的缺陷，滿足精細分析生物蛋白質組的需求，從而精確確定外源基因對受體生物蛋白質表達的影響，這方面已有很多報道。

多維液相色譜 (multidimensional liquid chromatography，MD-LC)技術是為適應蛋白質組學研究需要新近發展起來的一類分離技術。MD-LC一般可采用毛細管色譜柱或微色譜柱，蛋白質樣品經過在線或離線的離子交換色譜、分子篩色譜、聚焦色譜、反相色譜實現多維分離，并在色譜分離過程中或分離結束后進行酶切，最后直接送入質譜儀進行分析。MD-LC具有分離極端等電點、極端分子質量、低豐度及疏水性膜相關蛋白的特點，可彌補2-DE不易分離這類蛋白的缺陷，在轉基因生物分析中，特別是在新基因尋找和基因功能鑒定中，可發揮重要作用。

質譜 (mass spectrometry，MS)技術已廣泛用于生物分子的分析鑒定，其中串聯質譜的多反應監測技術 (multiple reaction monitoring，MRM)具有在復雜樣品中快速定量分析多種痕量成分的特點，是近年來鑒定大樣本量材料中已知蛋白質的最有效的蛋白質組學新技術。利用質譜定量蛋白質組技術，特別是MRM-MS/MS技術，可望避免傳統的轉基因生物檢測技術分析目標蛋白質時需先純化出蛋白質并制備可供使用抗體的缺陷，滿足快速和自動化地直接分析轉基因生物目標蛋白質的需求。

在轉基因農產品安全性檢測與研究中，蛋白質組學可發揮尋找新基因、鑒定基因功能、提高分子設計和新品種培育效率、評價轉基因農產品安全性等方面的作用，具有重要意義。但無論是基于質譜分析的非標記定量技術，還是基于質譜分析的穩定同位素標記定量技術，在分析轉基因農產品時，仍需要進行大量的研究積累，以建立適宜的分析技術體系，從而為轉基因農產品研究開發和安全評估提供新的有效的技術支撐。換言之，借助先進的基于質譜的定量蛋白質組學技術方法，構建基于蛋白質的轉基因農產品新檢測評價和研究技術體系，可克服現在常用的轉基因檢測方法的一些缺點，實現對轉基因農產品中蛋白質變化情況的深入了解，實現對大量樣本轉基因農產品目標蛋白質的精準、高通量和無標記檢測，實現無需抗體和純化蛋白即可直接對轉基因農產品中所有目標基因表達蛋白質的快速精確鑒定。

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