質子泵抑制劑與氯吡格雷聯用對大鼠頸動脈血栓形成及血小板活性的影響

郁 瓊 張 玉 (復旦大學附屬華山醫院老年科，上海 200040)

氯吡格雷單用或與阿司匹林聯合應用使消化道出血事件明顯增加，加用質子泵抑制劑(PPIs)可減少消化道出血的發生風險。隨著PPIs和氯吡格雷聯合應用增多，近年來關于PPIs對氯吡格雷療效影響的報道逐漸增多〔1，2〕。同時應用氯吡格雷與PPIs是否增加心血管不良事件的發生風險尚存在爭議〔3，4〕。本研究探討PPIs對氯吡格雷抑制血栓形成及抑制血小板活性的影響，并研究不同劑量奧美拉唑對氯吡格雷療效影響的量效關系。

1 材料與方法

1.1 材料 6月齡SD雄性成年大鼠，由復旦大學上海醫學院實驗動物中心提供。氯吡格雷(杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司)，奧美拉唑(常州四藥制藥有限公司)，埃索美拉唑(阿斯利康制藥有限公司)，泮托拉唑(杭州中美華東制藥有限公司);ADP(美國Sigma公司);甲基纖維素、FeCl3(國藥集團化學試劑有限公司);血小板VASP試劑盒(法國Biocytex公司)。

1.2 實驗分組 將60只SD大鼠隨機分為空白對照組、單用氯吡格雷組、奧美拉唑低劑量組、奧美拉唑高劑量組、埃索美拉唑組、泮托拉唑組，每組10只。各組藥物劑量為氯吡格雷(6.25 mg/kg)、奧美拉唑(10 mg/kg)、奧美拉唑(20 mg/kg)、埃索美拉唑(10 mg/kg)、泮托拉唑(10 mg/kg)。用0.5%甲基纖維素配制PPIs和氯吡格雷懸濁液，每天1次胃內灌注(每350 g大鼠1 ml)，共2 ml，連續7 d。末次服藥后1 h將大鼠麻醉，分離左側頸總動脈用于制備血栓模型，解剖分離腹主動脈取血3～4 ml用于血小板活性檢測。

1.3 FeCl3誘導頸動脈血栓模型制作 參照Kurz法改良制作，用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，頸部消毒、剃毛，解剖分離左側頸總動脈，長度約1.5 cm，在頸動脈下置小片塑料薄膜(2 cm×1.5 cm)，用于保護血管周圍組織，配制2.16 mol/L(35%)FeCl3溶液，將吸有20 μl FeCl3溶液的小片濾紙(1 cm×1.5 cm)敷于左側頸總動脈上，15 min后取下濾紙片，取下濾紙片60 min后，即制作出頸動脈血栓模型。

1.4 血樣本采集和處理 取下濾紙片60 min后，腹部剃毛消毒，于劍突下腹正中線打開腹腔，分離腹主動脈，分別從腹主動脈取血1.8 ml到含0.2 ml 3.8%枸櫞酸鈉的BD抗凝管中，共2管，輕輕搖晃2次混勻待測。1管全血樣本制備成貧血小板血漿(PPP)、富血小板血漿(PRP)，用于血小板聚集率的檢測，血樣本檢測必須在收集后2 h內完成。另一管全血樣本用于VASP-P程度檢測，血樣本檢測可在收集后24 h內完成。測試前血樣本室溫(18℃ ～25℃)儲存。

1.5 血栓重量測定 取血后迅速切下右側頸動脈血栓1.5 cm，放于濾紙上吸干殘血，用電子天平測定其重量。

1.6 ADP誘導血小板聚集率測定 采用Born氏比濁法，具體步驟如下:①PRP的制備:用3.8%枸櫞酸鈉抗凝的動脈血1.8 ml以1 000 r/min離心10 min，待離心機自然停止后取出(如出現溶血現象應重新采血)。小心吸取上層血漿即為PRP，移至另一塑料試管并做標志，放置30 min后再進行檢測。②PPP的制備:將吸除上層PRP后余下的標本以3 000 r/min離心10 min，再吸取上層血漿即為 PPP，調整 PPP為(10～20)×109/L。③分別吸取PPP和PRP，加入不同玻璃測試杯內，將測試杯置于恒溫體的預熱孔中預熱5 min。④以待測PPP調零后，用PPP調整富血小板血漿至250×109/L，將PPP測試杯取出，繼而將 PRP測試杯放入測試孔。⑤將 ADP(終濃度為5 μmol/L)迅速注入PRP測試杯，用血液聚集儀測定最大血小板聚集率(MPAR)。

1.7 VASP-P程度測定 該試劑盒是通過VASP磷酸化狀態來檢測P2Y12受體的活性。采用流式細胞術，具體步驟如下:①加樣:塑料管編號為 T1、T2、T3，T1 加 10 μl PGE1(終濃度10 μmol/L)，T2、T3 加 10 μl PGE1+ADP(終濃度10 μmol/L)，每管加10 μl全血，震蕩混勻器低速混勻2 s，室溫孵育10 min。②固定:在T1、T2、T3管中各加10 μl 3%多聚甲醛室溫下固定，震蕩混勻器低速混勻1～2 s，室溫孵育5 min。③細胞透化和免疫標記:T1、T2加10 μl抗VASP-P鼠單克隆抗體+透化劑，T3加10 μl陰性同型對照+透化劑，震蕩混勻器低速混勻1～2 s，室溫孵育5 min。④熒光標記和血小板計數標記:T1、T2、T3管各管加10 μl抗CD61-PE，震蕩混勻器低速混勻1～2 s，室溫暗處孵育5 min。3管中加2 ml稀釋劑后立即置2～8℃冰箱，24 h內上機進行流式細胞分析。⑤流式細胞分析:比較兩種測試狀態，去評估每個樣本中ADP抑制VASP磷酸化的能力。根據靜息態(PGE1)和激活態(PGE1+ADP)矯正的平均熒光強度(MFI)計算血小板反應性指數(PRI)，該指數反映P2Y12受體的抑制程度。

1.8 統計學方法采用Stata7.0軟件進行數據處理。計量資料以±s表示，兩樣本間均數的比較采用t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，多樣本間均數比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和檢驗。

2 結果

2.1 PPIs與氯吡格雷聯用對大鼠頸動脈血栓形成的影響 氯吡格雷組的血栓重量顯著低于空白對照組(P＜0.05)。高劑量奧美拉唑組、低劑量奧美拉唑組、埃索美拉唑組、泮托拉唑組的血栓重量與單用氯吡格雷組相比均無顯著差異(P＞0.05)。但高劑量奧美拉唑組的血栓重量顯著高于低劑量奧美拉唑組(P＜0.05)。見表1。

2.2 PPIs與氯吡格雷聯用對大鼠ADP誘導血小板聚集率的影響 氯吡格雷組的血小板聚集率顯著低于對照組(P＜0.05)。高劑量奧美拉唑組、低劑量奧美拉唑組、埃索美拉唑組、泮托拉唑組的血小板聚集率與單用氯吡格雷組相比無顯著差異(P＞0.05)。但高劑量奧美拉唑組的血小板聚集率顯著高于低劑量奧美拉唑組(P＜0.05)。見表1。

2.3 PPIs與氯吡格雷聯用對大鼠血小板VASP-P程度(PRI)的影響 單用氯吡格雷組的PRI顯著低于對照組(P＜0.05)。高劑量奧美拉唑組、低劑量奧美拉唑組、埃索美拉唑組、泮托拉唑組的PRI與單用氯吡格雷組相比均無顯著差異(P＞0.05)。但高劑量奧美拉唑組的PRI顯著高于低劑量奧美拉唑組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組血栓重量、血小板聚集率、PRI結果( ± s，n=10)

與空白對照組比較:1)P＜0.05;與低劑量奧美拉唑組比較:2)P＜0.05

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3 討論

氯吡格雷是P2Y12受體拮抗劑，通過選擇性地與血小板表面ADP受體結合，阻斷ADP對腺苷酸環化酶(AC)的抑制作用，促進血管舒張刺激磷蛋白(VASP)磷酸化，抑制纖維蛋白原與其血小板受體GPⅡb/Ⅲa結合而發揮抗血小板聚集作用及抗血栓形成作用。比濁法測定血小板聚集率在臨床應用廣泛，該方法比較方便、快速，成本低，成為金標準。此法在樣品處理過程中需離心，導致部分血小板激活和丟失等;而當血液中的一些大分子物質如脂蛋白、膽紅素等增多時會影響血漿濁度，進而影響檢測結果，故重復檢測變異大。運送過程中如有劇烈晃動，容易造成血小板失活。肝素會影響ADP誘導的血小板聚集率，因其可通過ADP作用于P2Y1受體誘導短暫的血小板聚集〔5〕。所以通過ADP誘導血小板聚集率反映氯吡格雷的抗血小板作用存在一定局限性。VASP檢測采用全血，故用血量少、無需離心，不是通過直接檢測血小板聚集所以不易受體外血小板激活的影響，具有更好的穩定性和重復性〔6〕。因此，在臨床研究中應用中優于血小板聚集率測定。目前，VASP檢測臨床研究應用較少。

本研究發現PPIs和氯吡格雷聯合使用沒有增加大鼠頸動脈血栓重量，對血栓形成沒有影響。因此認為PPIs對氯吡格雷的抗血栓作用沒有影響，不會增加心血管風險。結果與國外前瞻性研究結論一致〔3，4〕。同時本研究發現不同PPIs對ADP誘導血小板聚集率、VASP-P程度沒有顯著影響，認為PPIs對氯吡格雷抗血小板活性沒有影響。然而多項藥效學研究發現奧美拉唑顯著降低了氯吡格雷的抗血小板活性，埃索美拉唑、泮托拉唑對氯吡格雷的療效沒有影響〔7～9〕，推測PPIs對氯吡格雷療效影響的機制是由于PPIs和氯吡格雷均通過CYP450酶(主要為CYP2C19、CYP3A4)代謝，PPIs通過競爭CYP450同工酶而影響氯吡格雷轉化為活性代謝產物，使氯吡格雷抗血小板活性減弱。奧美拉唑對CYP2C19的親和力最強。CYP2C19基因多態性也是影響氯吡格雷及其代謝物的藥動學和抗血小板活性的重要因素〔10〕。但本研究結果稍有不同，分析可能的原因:①本研究采用動物實驗的研究方法，研究對象的同質性較好。研究時避免了其他經CYP2C19代謝的藥物的影響。最重要的是排除了冠心病的主要危險因素，如高脂血癥、糖尿病、吸煙、肥胖等，這些因素可能會影響血小板聚集功能。②藥物往往可以通過兩種以上的CYP450酶代謝，當其中一種受抑制時其他CYP450酶的活性可不受影響或代償性增加，這種情況下藥物代謝整體受影響可能不大，如果藥物的治療范圍足夠大，其效應甚至沒有變化。氯吡格雷在肝臟的氧化過程由多個CYP450的同工酶系統參與〔11〕，CYP2C19不是氯吡格雷的唯一代謝活化途徑，它可通過其他活化途徑(CYP3A4、CYP3A5、CYP1A2、CYP2B6等)代償。③雖然有藥理學研究顯示同時應用氯吡格雷與PPIs可降低前者的抗血小板療效，但是PPIs對氯吡格雷抗血小板療效的影響可能尚未達到引起臨床不良后果的程度。與之相似的阿托伐他汀和氯吡格雷(CYP3A4代謝)的相互作用，有研究表明阿托伐他汀可能會影響氯吡格雷的抑制血小板作用，并沒有產生具有臨床意義的不良后果〔12〕。④CYP2C19基因多態性不一定會影響氯吡格雷的療效。O'Donoghue等〔3〕研究顯示攜帶CYP2C19功能缺失的基因與心血管事件風險增加無關(HR=0.76，CI:0.39～1.48)。因此這兩類藥物的相互作用不一定會對氯吡格雷的抑制血小板活性產生影響。

根據本文結果，筆者推測奧美拉唑對氯吡格雷的影響可能存在一定劑量依賴性，而本項研究劑量尚未達到可顯著降低氯吡格雷抗血小板活性的程度。因此建議高劑量奧美拉唑和氯吡格雷聯用時仍需謹慎。

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