輔助性T細胞亞群的多樣性與分化的可塑性研究①

周 琳 周光炎 路麗明

(上海交通大學醫學院上海市免疫學研究所，上海200025)

通過選擇性表達和分泌專一的轉錄因子和細胞因子，CD4+Th細胞分為不同的亞群，分別行使不同的免疫生物學功能。不同的CD4+Th細胞亞群對于維持宿主的防御功能和機體正常的免疫調節有重要作用。

受細胞內外多種因素影響以及表觀遺傳機制的修飾與調控，細胞亞群具有相對穩定的表型［1］。比如，CD4+T細胞最初主要分成兩種亞群:表達T-bet和 IFN-γ 的 Th1，和表達 Gata3和IL-4的Th2［2］。這為我們理解T細胞特性和其發育的基因調控提供了一個簡單的模型。但Th1/Th2分類不能很好地解釋免疫與自身免疫中的許多問題，而且研究發現，極化的Th1和Th2細胞亞群在細胞因子IL-4、IFN-γ的作用下可以發生相互轉化，Gata3+Th2細胞在病毒感染的情況下可以重編程，表達T-bet并分泌IFN-γ。隨著研究的不斷深入，新近鑒定的CD4輔助性 T細胞亞群，已包括 Th9、Treg、Th17、Th22和Tfh，相關進展將有助于更好地理解正常和病理狀態下的免疫應答及其調控機制。

Th9亞群是一類主要分泌 IL-9和 IL-10的CD4+T細胞。在體外，Th9可由初始CD4+T細胞在IL-4和TGF-β共同誘導產生，也可單獨在TGF-β作用下由Th2細胞亞群分化而來。其專一的轉錄因子尚未明確，但干擾素調節因子IRF4和PU.1在Th9細胞亞群分化中起了重要作用。Th9細胞亞群在抗寄生蟲及變應性炎癥中十分活躍，與過敏性哮喘、炎性腸道疾病以及眾多自身免疫疾病密切相關［3］。體外研究發現Th9細胞亞群并不穩定，由雞卵溶菌酶(HEL)誘發的Th9細胞能夠在一系列的極化培養基中向 Th1、Th2、Th17 細胞轉化［4］，初始 T細胞分化成Th9細胞亞群需要IL-4和TGF-β的共同作用，若缺乏IL-4，初始T細胞在TGF-β的誘導下會向Treg細胞亞群分化［5］。

調節性T細胞(Treg)是CD4+T細胞譜系中的重要組成部分，參與維持機體的免疫穩態。主要分為胸腺來源的自然調節性T細胞(nTreg)和外周誘導的適應性調節T細胞(iTreg)。轉錄因子Foxp3表達于Treg細胞中，而其一直被認為是Treg專一轉錄因子，近期，Cretney［6］報道，Blimp-1和IRF4也能夠促進Treg細胞獲得免疫抑制能力，Beyer等［7］認為Treg在SATB1的誘導下能重新分化為效應T細胞，另外，Treg細胞能夠不表達Foxp3，卻能分泌促炎細胞因子，而最近發現的濾泡調節T細胞(Follicular regulatory T)可能來源于 Foxp3+前體細胞［8］。由此看出Treg也并非終末細胞，其具有一定的可塑性。Treg細胞的鑒定是一項重大發現，已知包括癌癥、自身免疫病、移植排斥在內的眾多疾病均與Treg細胞密切相關。

Th17細胞亞群能選擇性表達IL-17和特征性轉錄因子RORγt，主要作用于炎癥細胞，參與炎癥反應。Th17細胞的異常與自身免疫性疾病、感染性疾病以及癌癥等疾病密切相關［9］。對Th17細胞的認識使我們更深入地了解了輔助性T細胞的分化特點和自身免疫性疾病的發生機制。Th17細胞具有一定的可塑性，可以向分泌IFN-γ的Th1細胞亞群轉化［10］，同時，已完成分化的Th17細胞亞群在缺乏TGF-β維持的情況下，會同時表達轉錄因子RORγt和T-bet。

Th22細胞亞群主要分泌IL-22、IL-26和IL-13，其表型為CCR6+CCR4+CCR10+，特征性轉錄因子主要是芳香烴受體(AHR)。它能幫助機體通過炎癥對抗感染，且與風濕性關節炎、牛皮癬和克羅恩病等自身免疫性疾病發病密切相關［11］。

濾泡輔助性T細胞(Tfh)是最新鑒定的CD4+T細胞亞群，它是一群位于外周淋巴組織生發中心的T細胞。Tfh表達特征性轉錄因子Bcl-6、細胞因子IL-21以及特征性的表面分子PD-1、CXCR5和ICOS等［12］。Tfh細胞亞群能夠促進B細胞的類別轉換和體細胞高頻突變，其功能失調會導致系統性紅斑狼瘡和其他自身免疫性疾病的發生。Tfh細胞可能是最具可塑性的細胞亞群，Tfh在體外能夠轉化成Th1、Th2和 Th17，相反地，Th1、Th2和 Th17細胞亞群也可以獲得Tfh細胞的特性［13］。體內分離出的Tfh細胞也可以表達其他輔助性T細胞的特征性細胞因子。在派爾集合淋巴結中，Foxp3+T細胞可以轉換成為Tfh細胞［14］。因此，是否應該把Tfh細胞和其他輔助性T細胞一樣歸為一類特定細胞譜系還存在爭論。或許它僅僅是Th1、Th2、Th17和Treg細胞分化過程的一個階段。另外雖然IL-21主要由Tfh細胞分泌，但是Th17和Th1等細胞也可以分泌 IL-21［15］。

如果輔助性T細胞亞群具有多樣性與分化的可塑性，那么決定其表型分化可塑性的影響因素和調控機制是什么呢?

目前提出主要有以下因素:(1)多種轉錄因子的作用;(2)細胞分化過程中表觀遺傳學格局的改變;(3)微小RNAs(microRNAs)的調控作用。

1 輔助性T細胞可以表達多種關鍵轉錄因子

定義一個細胞亞群的基本標準包括細胞的不同表型以及專一的、特征性轉錄因子。然而，越來越多的研究表明CD4+T細胞能表達多種關鍵轉錄因子。例如，FoxP3+細胞可以表達與其功能密切相關的轉錄因子 T-bet、Gata3、RORγt、STAT3 和 Bcl6。某些Treg細胞對IFN-γ產生應答，表達轉錄因子T-bet，從而促使CXCR3的表達，有利于Treg細胞遷移至Th1細胞亞群相關的炎癥部位［16］。Gata3是Th2細胞亞群的關鍵轉錄因子，但在胃腸道和皮膚中的Treg細胞也可以表達Gata3，同時TCR和IL-2的刺激也可以誘導Gata3在Treg細胞表達。盡管Gata3對于維持Treg細胞的功能和內穩態不是必需的，但它可以維持FoxP3的表達，防止Treg細胞轉變成效應T細胞［17］。許多 CD4+T細胞共表達 FoxP3和RORγt，這些 T細胞表達 CCR6，激活后分泌 IL-17，同時也具有抑制活性［18］。STAT3是促使 Th17和Tfh細胞分化的一種重要轉錄因子，將Treg細胞中的STAT3基因敲除后同樣會導致自身免疫反應［19］。最后，位于生發中心、表達 Bcl6的 Treg細胞，有抑制B細胞免疫應答的功能［8］。以上研究表明，對效應細胞譜系有重要作用的某些轉錄因子復合物能被Treg細胞所用，從而對效應細胞發揮特異的抑制作用。以此來看，Treg細胞可以看作是一群異質性的動態細胞群體。

同樣，炎癥性 Th17細胞亞群可以同時表達RORγt和 T-bet或 Gata3。在 EAE模型中，T-bet+RORγt+T細胞是具有高致病性的，T-bet+T細胞的表達是致病的重要原因，即便IFN-γ并不參與［20］。

在寄生蟲感染的情況下，Gata3可以和Bcl6共表達［21］。事實上，CD4+T細胞普遍表達 Bcl6，而不僅僅局限于Tfh細胞。IL-6和IL-21通過STAT3途徑促進Tfh細胞亞群增殖，但Tfh細胞在缺乏這些因子的情況下也可以分化。這是因為IL-12通過STAT4信號途徑能夠促進IL-21和Bcl6的分泌與表達［22］。早期Th1細胞亞群可以同時表達Bcl6和T-bet。所以，這些因子不僅相互拮抗各自的功能，還能共同抑制相關基因表達。

相反地，即使一種特征性轉錄因子對于某種細胞亞群的分化是必需的，但僅僅有它仍是不夠的。正常Treg細胞分化需要Foxp3，但Foxp3的表達不足以誘導完整的Treg細胞亞群的表型，而且即使沒有Foxp3，某些 Treg細胞仍具有相關功能［23］。同樣，沒有T-bet也不能停止Th1細胞亞群的分化［24］。

由此可以看出:在輔助性T細胞中，表型和關鍵轉錄因子的表達并不是簡單的一對一關系。主要轉錄因子的作用與經典細胞生物學中描述的功能相去甚遠，它們既不是絕對必要，也不是唯一的，況且同時表達多種關鍵轉錄因子是時常發生的。因此，不能簡單地認為終末分化的細胞只表達專一的轉錄因子，事實上多種關鍵轉錄因子共表達的提法才更準確。這些因子能受內外界的因素動態調控，根據環境需要改變T細胞的功能。

2 細胞分化過程中表觀遺傳學參數的改變

完全分化的細胞經過多次細胞分裂趨向于表達固定的細胞表型，不會繼續存在誘導其分化的信號。不同的細胞表型不僅僅是轉錄因子調控表達的結果，也可能是由基因調控的核染色質結構變化所引起。

組蛋白N末端可以通過乙酰化、甲基化和磷酸化作用被共價修飾。組蛋白修飾與基因表達密切相關，通過改變核染色質的結構可以激活或抑制基因轉錄［25］。例如，組蛋白 H3賴氨酸 4三甲基化(H3K4me3)與基因活化密切相關［26］。相反，polycomb蛋白復合體可以催化組蛋白H3賴氨酸27三甲基化(H3K27me3)，抑制基因表達。

在輔助性T細胞分化為相應的細胞譜系過程中，其特征性細胞因子基因會顯示活化標志(H3K4me3)，而在其他細胞譜系中顯示抑制信號(H3K27me3)。比如 Th1細胞亞群的 Ifnγ基因和Th2細胞亞群的IL4基因的甲基化狀態的作用相反。Th17細胞亞群與它們相比卻有相當大的內在不穩定性。當Th17細胞亞群受IL-2刺激時，其Ifng基因座位迅速發生染色質重塑，Th17細胞亞群的不穩定性與之密切相關［27］。

更重要的是，組蛋白甲基化對編碼這些關鍵轉錄因子基因的調控并不是簡單的激活或抑制。即使轉錄因子不表達，也可以同時顯示出抑制和活化的表觀遺傳標志。例如，在Th1細胞亞群中，活化信號H3K4me3與 Tbx21基因是密切相關的［28］。盡管Th2和Th17亞群中存在抑制性標志H3K27me3，但也同時存在活化信號H3K4me3［29］。這些同時被兩種核染色質修飾所標記的區域被稱為二價結構域(bivalent domains)。T-bet基因座位的這種靜止的狀態可以解釋在Treg、Th17和Th2細胞亞群中T-bet是怎樣被誘導的。同樣，在極化的Th1、Th2和Th17細胞亞群中Bcl6基因座位存在活化信號H3K4me3標志，而 Tfh細胞亞群中 Tbx21、Rorc和Gata3基因也有激活標志［15］。這說明在已經定型的細胞如Th1、Th2和Th17細胞亞群中轉錄因子能被很容易地誘導，這為支持Tfh細胞亞群的可塑性提供了證據。應當指出的是:二價結構域的出現是細胞亞群異質性的一種反映，但細胞因子基因的轉錄激活并沒有如此復雜的現象。

3 微小RNA調控CD4+Th細胞的分化和表型維持

微小RNA(miRNA，miR)是約為22個核苷酸的非編碼小RNA，能與靶mRNA結合，抑制其翻譯或導致其降解。Drosha和Dicer是miRNA產生的兩種關鍵酶。它們的缺失與自身免疫病的發生和Treg細胞亞群的不穩定性密切相關［30］。在人和鼠的各種輔助性T細胞中發現了不同miRNA的表達，這說明每種miRNA對于某些細胞亞群可能有獨特的作用。更多的研究揭示了miRNA調控輔助性細胞的分化和表型維持。

研究已發現miR-125b有助于維持輔助性T細胞的初始狀態［31］，而miR-182則可以促進活化輔助性T細胞克隆擴增［32］。miR-29通過 T-bet、Eomesodermin和 IFN-γ 調節 Th1細胞亞群的分化［33］;miR-155則會影響Th1、Th2亞群的分化和Treg細胞亞群的 發 育 成 熟［34，35］;miR-326 通 過 Ets-1 促 進Th17細胞亞群的分化［36］;miR-146a對 Treg細胞的抑制功能是非常重要的［37］。另一方面，Bcl6也能抑制多種miRNA的表達，包括能抑制與CXCR5表達相關性miR-17-92的表達，以此調控Tfh細胞的表面標記［38］。對miRNA調控CD4+Th細胞的分化和表型維持的研究將有助于我們更準確地了解決定CD4+細胞表型穩定性的因素，甚至可能會改變我們對重要轉錄因子相互作用的認識，但相關證據仍不充分，需進一步研究。

4 結論

CD4+輔助性T細胞能夠分化成多種穩定的細胞亞群，但也存在一些分子機制使該分化過程具有相當的可塑性。組蛋白表觀遺傳學分析也表明:同一細胞亞群中同時存在著相對穩定的終末分化以及可塑性兩種可能。而最近的研究表明，多種miRNA參與調控CD4+T細胞表型的穩定性。因而對生物體而言，CD4+T細胞亞群分化的可塑性，有利于宿主產生有效的免疫應答機制。因而深入了解調控CD4+T細胞穩定性和可塑性的內外信號通路，將有助于開發出有效的治療方法來控制自身免疫性疾病和其他免疫相關疾病。

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