印度梨形孢的研究進展及其在農業生產上的應用前景

徐澤凌，陳復旦，毛碧增

(浙江大學生物技術研究所，浙江杭州 310058)

菌根是土壤中菌根真菌與高等植物的根系形成的一種共生體［1］，大部分陸生植物都與菌根真菌有著共生關系，真菌有利于生態系統中養分的循環，能夠幫助植物從土壤中吸收營養物質，協助植物抵御不良環境的脅迫［2］。同時真菌可以利用植物光合作用的產物［3］，如叢枝菌根 (AM)真菌能夠和甘蔗等80%的維管開花植物相互作用，加快植物生長，提高對病害等的抗性［4-6］。然而至今還未獲得AM真菌純培養，這在很大程度上限制了AM真菌分類學和生理學的發展［7］。

印度梨形孢 (Piriformospora indica)是一種類似于AM真菌的內生真菌，不同的是，印度梨形孢能夠在人工培養基上培養［8］，且定殖范圍比AM真菌更為廣泛，無論在單子葉還是雙子葉植物，甚至是苔蘚植物上都能夠定殖［3］。印度梨形孢的生物學功能已經明確，在促進植物生長、增強植物抗逆等方面都有顯著作用。目前，國內外已有很多研究對印度梨形孢的作用機制進行探索。本文針對印度梨形孢與植物的互作機制及轉化體系的研究現狀進行總結，以期為印度梨形孢在農業生產中的應用提供參考。

1 印度梨形孢植物互作機制

印度梨形孢作為一種定殖范圍廣的有益真菌，在寄主植物根部定殖后，能引發一系列的生物學效應。目前研究發現，印度梨形孢的定殖主要會引起相關基因表達的改變、激素變化以及一些信號通路的改變等。

1.1 相關基因表達

Schuck等［9］研究發現，HSPRO(ORTHOLOG OF SUGAR BEET Hs1pro-1)基因在印度梨形孢和煙草的互作中起著重要作用，該基因表達的產物可促進早期幼苗的生長，平均比一般野生型植株增加30%的生物合成量。試驗中發現，野生型煙草植株中檢測不到HSPRO的轉錄產物，而定殖了印度梨形孢的植株中，該基因有著明顯的表達。在擬南芥中，HSPRO1和HSPRO2會與SNF1依賴型的蛋白激酶 SnRK1中的 AKINβγ亞基相互作用，通過SnRK1控制其他基因的表達和調控相關酶的活力來調節代謝。同時，還有其他基因也被報道在印度梨形孢的定殖過程中其表達量會發生變化。例如，當印度梨形孢定殖于大麥根部的過程中，TLP基因被誘導，表達產生TLPs，TLPs能夠在跨膜轉運和囊泡運輸中起作用，利于印度梨形孢的定殖［10］。

1.2 激素

研究報道，當piTam1基因被沉默之后，導致生長素的表達量有所減少，同時發現大麥根部印度梨形孢的定殖量也會隨之減少，說明生長素可能是印度梨形孢定殖過程中的一個促進因子［11］。另外，乙烯在印度梨形孢的定殖過程中是必不可少的。印度梨形孢的定殖可分為兩個階段，首先是活體細胞階段，之后伴隨的是細胞致死階段［11］。Khatabi等［12］研究發現，在第2個階段，乙烯能夠增強印度梨形孢在擬南芥根部的定殖，而損壞的乙烯信號通路會減少印度梨形孢的定殖。

1.3 信號傳導

Qiang等［13］研究發現，在印度梨形孢定殖的細胞致死階段，印度梨形孢首先抑制了內質網應激信號的傳導，最后導致一種半胱天冬氨酶依賴型，以液泡為媒介的細胞死亡。不過，印度梨形孢只定殖于成熟根部的部分區域，并不進入根部的維管系統，因此并不會對根部的生長和功能造成影響。

除上述基因、激素和信號傳導在印度梨形孢定殖過程中的作用之外，還有一些蛋白也起到了關鍵性的作用。比如，pii-2基因能編碼一種富含亮氨酸的蛋白At5g16590，能夠促進印度梨形孢和植物之間的識別，突變體則無法識別印度梨形孢［3］。

2 印度梨形孢遺傳轉化

印度梨形孢是一種多核絲狀真菌，通過DAPI染色發現，每個細胞內含有2～10個細胞核不等［14］，印度梨形孢的遺傳相當不穩定，大大增加了其轉化難度。目前已有印度梨形孢轉化的相關報道。

Zuccaro等［14］利用 PEG法成功將線性載體pvv26轉入印度梨形孢中，2周后獲得轉化子，轉化效率為2%。同時發現，質粒載體pBShhn-pTEF轉化效率較低，約為1.5%。然而，在原生質體的制備方面，Zuccaro等［14］報道，利用木霉屬溶壁酶未能獲得印度梨形孢的原生質體，而課題組分別利用裂解酶、glucanex、溶壁酶和纖維素酶制備原生質體時發現，只有經溶壁酶處理后，才能獲得符合轉化要求、濃度為107個·mL-1的原生質體懸浮液，在這點上和Zuccaro等稍有不符。

Kumar等［15］利用更簡便的電穿孔法也成功獲得了轉化菌株。電穿孔法是利用一個高壓的電脈沖在細胞膜表面制造出一定量的親水或疏水的微小通道，讓 DNA通過擴散轉入細胞膜內［16］。在12 500 V/cm的條件下，把含有RNAi結構的PiPT基因的質粒成功導入印度梨形孢中，這也是首次報道RNAi在印度梨形孢中的應用。

3 印度梨形孢在農業生產上的應用

印度梨形孢在植物生長中起重要作用，其一系列生物學功能已被證實，如能加快植物生長、促進植物營養物質的吸收和誘導植物產生抗逆性等。印度梨形孢在農業生產應用中有著廣闊的前景。

3.1 加快植物生長

印度梨形孢是一種植物內生型真菌，在植物體內產生的最明顯的生理效應就是促進植物生長，這一點已在多種植物中被證實。Fakhro等［17］研究發現，將印度梨形孢定殖于番茄的根部時，印度梨形孢有利于改善番茄的生長，使其葉的生物量增加20%;此外，在水培過程中研究發現，印度梨形孢能使番茄果實鮮重增加100%，干重增加20%。

Sun等［18］以中國卷心菜為試驗材料研究發現，與印度梨形孢共培養15 d的卷心菜幼苗長勢明顯好于未經過共培養的對照組，根部鮮重增加38±5%，葉部鮮重增加46±6%。同時，主根和側根的生長情況也有較大幅度的提升，葉片鮮重、根部鮮重、氣孔數量等也有明顯變化。在研究印度梨形孢和玉米的互作時，Kumar等［19］發現，在共培養45 d后，定殖有印度梨形孢的玉米植株干重相比于對照組可提高1.8倍。

印度梨形孢在大麥、小麥、擬南芥、煙草、玉米等植物上的促生作用也已得到驗證。印度梨形孢對植物的促生能力一般在50%左右，但在很大程度上，由于試驗條件和環境差異的影響，促生能力存在較大的不同［20］。

3.2 促進植物營養物質吸收

磷是植物生長過程中很重要的一種元素，但土壤中的磷很少以可溶性狀態存在，因此很難被植物利用。植物吸收磷的主要方式有兩種，一種是根部直接吸收，另一種就是依賴共生真菌的協助［21］。王鳳讓等［22］在研究印度梨形孢及其近似種Sebacina vermifera在番茄上的定殖，以及在不同磷水平下對番茄生長發育的影響時發現，在低磷條件下，接種印度梨形孢或S．vermifera的植株體內磷含量高于未接種的對照組，根系酸性磷酸酶活性顯著低于未接種植株。說明印度梨形孢和S．vermifera能夠促進番茄對磷的吸收，增加植株內磷的含量，提高植株對低磷逆境的抵抗能力。

除了磷元素，Sarma等［23］在研究印度梨形孢對西紅柿生長的作用時發現，在印度梨形孢和熒光假單胞菌R81的作用下，西紅柿植株在氮、磷、鉀的吸收上分別能提高178%，102%和126%。

植物生物量的增加很大程度上依賴于植物對外界養分的吸收，印度梨形孢能夠參與調節植物對土壤中磷和氮的吸收。試驗表明，在擬南芥和番茄中，印度梨形孢能刺激NADH依賴的硝酸鹽還原酶的活性，激活相關基因的表達［24］。因此，在作物的栽培中，可通過印度梨形孢和植物根部的互作來促進營養物質的吸收。但是，在印度梨形孢的定殖能增強硝酸還原酶的表達，同時也能促進對氮的吸收的觀點上，Franken［20］認為，這里有一個問題還不清楚，是因為印度梨形孢定殖于植物根部促進植物生長，加強了對營養物質的吸收，還是因為通過加強對營養物質的吸收以促進植物的生長?因此這方面具體的機制還有待進一步的研究。

3.3 誘導植物抗逆

Sun等［18］研究表明，與印度梨形孢共培養的卷心菜在抗干旱方面強于非共培養的對照組，將共培養的試驗組和空白對照組在相同的干旱環境下進行培養，4周后用PEG溶液處理，并于4 d后觀察，發現對照組在PEG處理后受到嚴重的干旱脅迫影響，而試驗組未表現出明顯脅迫跡象。另外，陳佑源等［25］利用油菜研究發現，定殖印度梨形孢的油菜，其抗旱性能有顯著的提高。分析表明，印度梨形孢提高油菜對干旱脅迫的抗性可能與MDA含量、質膜透性、Pro含量、抗氧化酶活性和干旱相關基因的表達有關。

Baltruschat等［26］以代謝活力、脂肪酸化合物、脂類過氧化物、抗壞血酸還原酶等為生理指標，對大麥中印度梨形孢介導的抗鹽生化機制所做研究發現，印度梨形孢定殖的植株具有生長優勢，同時弱化了鹽敏感的大麥品種葉片中的NaCl誘導脂質過氧化作用、代謝能量外溢和葉片中的脂肪酸稀釋等過程。

另外，印度梨形孢在抗病方面也有相關報道。Molitor等［27］發現，印度梨形孢定殖的大麥能對白粉病菌的感染產生抗性。在冬小麥的溫室培養試驗中，Serfling等［24］研究發現，印度梨形孢定殖的冬小麥能夠顯著降低鐮刀菌、小麥基腐病菌、白粉病菌的侵染，但在外界低溫環境下，印度梨形孢對葉部病菌侵染抑制效果不是很理想，和未接種印度梨形孢的對照組幾乎無區別。

3.4 其他應用

除以上功能外，印度梨形孢還有其他一些作用。例如，在植物組培過程中，可利用印度梨形孢來煉苗。據Sahay等［28］報道，與印度梨形孢共培養的煙草組培苗在移栽至大田中時，存活率可達88%～94%，而未經過共培養的僅有62%。另外在與藥用植物毛喉鞘蕊花的相互作用中，印度梨形孢不但能加快其生長，增加其產量，甚至還能使其次生代謝物發生變化［29］。

4 存在問題及展望

印度梨形孢定殖廣泛且功能多樣，具有促生、增產、抗逆等多種功能，相比于其他菌根真菌有著許多明顯的優勢。基于此，印度梨形孢越來越受到研究關注，但由于缺乏和寄主植物互作分子機制的認識，其應用受到限制［3］。同時，由于印度梨形孢遺傳轉化體系構建存在一定的難度，影響對印度梨形孢的進一步深入研究。另外，關于利用印度梨形孢來促進植物生長，增強其抗逆性是否會引起植物本身營養價值的改變的問題目前也尚未清晰。因此，這些方面都還需要進一步研究確定。此外，印度梨形孢并沒有能夠真正應用于大田中，只是停留在實驗室摸索嘗試階段［30］，其利用價值有待進一步開發。

隨著對印度梨形孢研究的不斷深入，在闡明其作用機制的同時，可將其進行產業化生產，用于大田作物的栽培中，能有效促進作物生長，提高干旱、高鹽地區作物的忍耐性，增強作物對病害等的抗性，提高作物產量;或將其研制成生物菌肥或生物基質，可用于貧瘠土壤的改良，能有效地減少化學肥料的使用，減輕由于化學肥料的使用而帶來的環境污染［8］。隨著研究的進一步深入，印度梨形孢的作用將會越來越顯著，在可持續發展的農業生產中的地位也將會越來越突出。

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