甲殼素、殼聚糖對水產動物免疫功能的影響研究進展

浙江大學動物科學學院 王 月 楊彬彬 邵慶均

在集約化程度不斷提高的現代養殖模式下，營養缺陷、環境因素等易誘導水產動物發生疾病，并且一旦發病嚴重，極易以水生環境為媒介發生大規模的傳播和感染，引起水產動物大量死亡。因此，水產動物疾病的預防工作成為水產養殖中極為重要的環節。從營養調控的角度增強水產動物的免疫能力成為防控水產動物疾病的研究熱點。甲殼素和殼聚糖作為飼料添加劑，在調節水產動物的免疫功能、提高抗病能力等方面效果明顯。

1 甲殼素和殼聚糖的理化性質

甲殼素，又稱幾丁質，是一種天然黏多糖，廣泛存在于甲殼動物、昆蟲的外殼及真菌、藻類的細胞壁中，自然界中其產量僅次于纖維素。天然甲殼素是聚2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖以1，4糖苷鍵連接而成的無分支的線形高分子聚合物。甲殼素是除蛋白質外數量最大的含氮天然有機化合物。甲殼素可以被溶菌酶、幾丁質酶降解，具有較低的免疫原性，而生物相容性和生物降解性較好。甲殼素與纖維素結構十分相似，不溶于水和大多數有機溶劑，化學性質穩定（Ravi Kumar，2000）。

通常情況下，甲殼素在堿性條件下進行乙酰化處理的產物是殼聚糖。自然界中的多聚糖一般為酸性或中性，而殼聚糖是自然界中少有的堿性高聚物。因此，較易形成多氧鹽、螯合金屬離子等。程珊珊等（2011）研究報道，殼聚糖對水體中鎘離子（Cd2+）和鉛離子（Pb2+）具有較強的吸附作用。

2 甲殼素及殼聚糖的免疫促進作用

有研究認為，甲殼素及殼聚糖可以刺激機體的非特異性免疫，提高機體抵抗細菌及病毒的能力，并且具有抗腫瘤細胞的活性 （Nishimura等，1984）。

甲殼素和殼聚糖可以活化巨噬細胞和自然殺傷細胞來表達一些引起發炎反應的細胞因子，如白介素-1、集落刺激因子和γ干擾素等（Lee等，2008）。并且有研究還發現，甲殼素和殼聚糖的混合程度對其發揮免疫促進劑的作用有關，由30%甲殼素和70%殼聚糖混合后產生的活化巨噬細胞的作用比單純的甲殼素或殼聚糖的作用效果更佳（Iida等，1987）。有的研究則報道，在抵抗念珠菌感染上，甲殼素促進免疫的作用與給予的劑量有關。

近年來也有試驗表明，天然甲殼素因分子質量巨大、聚合度高而未表現出顯著提高機體免疫指標的作用，相比之下，經過處理后分子量較小的殼聚糖或甲殼素片段則在增強免疫方面有著較強的作用。Shibata等（1997）首先在小鼠上用細小的甲殼素顆粒（1～10 μm）進行靜脈注射，發現小片段的甲殼素可以活化肺泡巨噬細胞以表達如白介素-12、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白介素-18，并刺激自然殺傷細胞分泌干擾素INF-γ。并且進一步證明了這些細胞因子的產生是基于一種依賴甘露糖受體的細胞吞噬作用途徑。甲殼素顆粒在甘露糖受體的協助作用下完成吞噬細胞的內化作用，再由巨噬細胞溶菌酶和N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶降解。

Reese等（2007）在研究甲殼素體內促免疫作用時，將甲殼素和殼聚糖顆粒由表達綠色熒光蛋白標記的白介素-4的小鼠鼻腔直接注入肺部，結果發現，幾小時后一些分泌白介素-4的免疫細胞，尤其是嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞在肺部被大量募集。表明甲殼素可以活化一些非特異性免疫細胞，引起過敏類的發炎反應。

3 甲殼素及殼聚糖對水產動物免疫功能的影響

目前，針對甲殼素及殼聚糖對水產動物免疫功能的影響上研究報道較多，絕大多數是關于甲殼素及殼聚糖對水產動物非特異性免疫系統的影響，而很少涉及其對特異性免疫系統的作用。這可能與目前對水產動物特異性免疫系統的研究并不十分深入有關。近年來，隨著虹鱒甲殼素結合蛋白的發現，關于甲殼素對魚體免疫作用的研究進一步深入（Rusell等，2008）。甲殼素結合蛋白存在于虹鱒的鰓、脾臟、肝竇、腎間質腸、皮膚、魚鰾以及白細胞內部。這種蛋白質與人和嚙齒類的一種血漿凝集素屬于同源蛋白。Schlosser等（2009）在小鼠體內也發現了一種甲殼素受體蛋白，這種甲殼素受體蛋白是一種由FIBCD1基因表達的同源四聚體跨膜蛋白，在包括魚類的脊椎動物中結構比較保守，并在消化道中高度表達。這種受體通過一種與乙酰化的甲殼素或甲殼素片段高親和性的鈣依賴性途徑參與到細胞內吞作用中。

3.1 海水魚類 Esteban等（2000）用直徑小于10 μm的甲殼素顆粒對金頭鯛（Sparus aurata L.）進行靜脈注射和腹腔注射，發現經腹腔注射的金頭鯛其體液免疫和細胞免疫指標均顯著提高。天然補體溶血活性在注射5 d后提高，但沒有達到顯著水平；呼吸爆發和吞噬細胞吞噬能力分別在3 d和5 d后達到峰值；細胞毒素活性在3 d后顯著提高并一直持續至注射后10 d。而靜脈注射對金頭鯛的各項免疫指標均未產生顯著影響。Esteban（2001）用甲殼素添加水平分別為25、50 mg/kg和100 mg/kg的飼料飼喂初重為（125±13）g的金頭鯛，分別在第2、4、6周測定其各項非特異性免疫指標，結果發現，飼喂水平為25 mg/kg和50 mg/kg的金頭鯛非特異性免疫得到顯著提高；天然補體溶血活性和細胞毒素活性在飼喂2周后顯著提高，呼吸爆發和吞噬細胞吞噬能力分別在飼喂甲殼素4周和6周后顯著提高；而溶菌酶活性和生長性能則沒有受到顯著影響。試驗結果表明，適量的甲殼素可以提高魚體免疫功能，而添加量過高則可能不會起到提高免疫功能的作用。并且甲殼素對不同免疫指標的影響具有時間差異。Cuesta和Esteban（2003）研究進一步證明，甲殼素顆粒的大小對免疫細胞的吞噬能力也有影響。用含有不同大小的甲殼素顆粒的培養液培養金頭鯛的白細胞，結果發現，白細胞只能吞噬直徑小于10 μm的甲殼素顆粒，并在培養1～4 h后白細胞的吞噬能力得到提高，但其呼吸爆發未受到顯著影響。金頭鯛白細胞吞噬甲殼素顆粒很可能是通過甘露糖/巖藻糖受體途徑，這種受體主要識別含氨基或亞氨基的抗原并激發白細胞的一系列免疫反應，目前僅在哺乳動物和金頭鯛中發現，而在其他魚類中尚未見報道（Cuesta 和 Esteban，2003）。

3.2 淡水魚類 Choudhury等 （2005）給初重為（13.40±0.17） g 的露斯塔野鯪（Labeo rohita L.）飼喂甲殼素添加水平為25 mg/kg和50 mg/kg的飼料，15 d后發現，對露斯塔野鯪的增重率、特定生長率、飼料效率、蛋白質效率等均無顯著影響，也未顯著提高試驗魚的白細胞數量、呼吸爆發等免疫指標。用嗜水氣單孢菌（Aeromonas hydrophila）進行攻毒試驗后，飼喂甲殼素的試驗魚存活率未得到顯著提高。這可能與甲殼素添加水平過低不足以起到免疫增強劑的作用有關。Gopalakannan和 Arul（2006）試驗證明，鯉魚（Cyprinus carpio）在飼喂1%甲殼素或殼聚糖后，其溶菌酶活性和利用NBT法測得鯉魚嗜中性粒細胞呼吸爆發在飼喂30 d后達到峰值，并且飼喂殼聚糖組的溶菌酶活性約是飼喂甲殼素組的2倍，峰值過后雖一定程度下降但仍顯著高于對照（P＜0.001）。45 d和90 d后用分別用嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）進行攻毒試驗，發現試驗45 d后飼喂甲殼素和殼聚糖組的相對成活率分別是40%和80%，而90 d后分別降低到37.5%和68.9%。相對成活率是反映免疫促進劑或疫苗有效性的指標，一般大于50%即可視為有效提高免疫。試驗結果表明，一定濃度的殼聚糖可以提高鯉魚的非特異性免疫功能，并且作用效果優于甲殼素。華雪銘等（2007）研究了飼料中添加殼聚糖對暗紋東方鲀（Fugu obscurus）抗病力和免疫功能的影響。結果發現，用添加了0.2%、0.5%、1.0%的殼聚糖的基礎飼料投喂平均體重為（3.15±0.05）g暗紋東方鲀 2個月后，脾臟自然殺傷細胞的殺傷活性顯著提高；試驗魚的頭腎B淋巴細胞體外培養時分泌的IgM顯著增加。陳勇等（2010）以含0.50%殼聚糖A（分子量較小）和0.50%殼聚糖B（分子量較大）的基礎飼料分別投喂2齡異育銀鯽 （Carassius auratus gibelio），64 d后發現，兩種殼聚糖均可顯著提高異育銀鯽外周血淋巴細胞數量、白細胞吞噬活性和脾臟溶菌酶活性（P＜0.05），顯著降低外周血多形核細胞數量（P＜0.05），并且殼聚糖A能夠顯著提高異育銀鯽脾臟B淋巴細胞轉化能力；同時顯著提高異育銀鯽血清中T3的含量 （P＜0.05），顯著降低異育銀鯽血清中皮質醇和T4淋巴細胞的含量（P＜0.05）。試驗結果表明，殼聚糖通過提高血清T3水平、降低血清皮質醇水平增強異育銀鯽的非特異免疫功能。并且，試驗也驗證了殼聚糖分子量的大小可能影響其對魚類細胞免疫的作用，分子量較小的殼聚糖具有更好的增強免疫的效果。翟少偉和劉淑蘭（2011）與賈景濤等（2012）分別試驗研究了水體中添加殼聚糖后對水環境鎘或鋅致羅非魚（Oreochromis Niloticus）急性中毒的影響。結果表明，養殖水體中加入一定濃度的殼聚糖對鎘或鋅致羅非魚急性毒性有顯著改善作用，試驗組魚的病死率顯著低于對照組。這可能與殼聚糖可以螯合水體中重金屬離子的功能有關。

3.3 甲殼類 Powell和 Rowley（2007）在普通濱蟹（Carcinus maenas）的餌料中添加了 5%和10%的甲殼素，結果發現，試驗組蟹成活率顯著提高，但非特異性免疫指標并無顯著改善，而肝胰臟和血淋巴中細菌總數顯著低于對照組。這可能與甲殼素的添加改善了試驗蟹的消化道微生物群系有關。Wang 和 Chen（2005）用 4、6、8 μg/g 的甲殼素和 2、4、6 μg/g 殼聚糖分別注射均重 （10.4±0.7） g凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的頭胸部腹側竇后，用溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）進行攻毒試驗，6 d后發現，注射過甲殼素或殼聚糖組的試驗蝦成活率顯著高于對照組，并發現注射6 μg/g甲殼素和4、6 μg/g殼聚糖的試驗蝦其血細胞總數和呼吸爆發在2 d后顯著提高，酚氧化酶活性在注射6 d后一直保持較高水平。Zhu等（2010）用添加水平分別為5、10 mg/g和15 mg/g甲殼素或殼聚糖的飼料飼喂初重為20 g左右的克氏原螯蝦（Procambarus clarkia），4周后用感染了白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的克氏原螯蝦尾部肌肉飼喂試驗蝦進行攻毒試驗。結果發現，10 mg/g殼聚糖飼喂組累積死亡率顯著低于對照組（P＜0.05）。各試驗組克氏原螯蝦的血細胞總數、原酚氧化酶活性和雙氧化物歧化酶活性（SOD）等免疫指標均顯著提高。并且飼喂殼聚糖的試驗組蝦各項指標均顯著高于飼喂甲殼素的試驗組。

另外，也有研究證明，甲殼素或殼聚糖對某些水產動物的免疫功能無顯著的改善作用。Lin等（2011）用添加了0.2%殼聚糖的飼料飼喂錦鯉（Cyprinus carpio koi），56 d 后發現，無論是白細胞總數，還是非特異性免疫的體液免疫、細胞免疫指標均未發生顯著變化。

4 小結

綜上所述，大量試驗研究表明，適量添加甲殼素或殼聚糖可以增強水產動物的非特異性免疫功能、提高水產動物抵抗和防御病原微生物感染的能力。但是，目前為止對甲殼素和殼聚糖對水產動物的作用機理研究并不深入，因此可以借鑒其在小鼠等哺乳動物中的研究成果，為甲殼素和殼聚糖在水產動物中的研究提供引導和方向。

今后應針對以下問題進行深入研究：（1）進一步明確甲殼素和殼聚糖的作用機制和影響因素。（2）深入了解添加方式、給予途徑、添加水平和顆粒大小對甲殼素和殼聚糖作用的影響，針對不同水產品種摸索最佳添加水平。（3）開展甲殼素、殼聚糖與其他免疫增強劑或飼料添加劑的協同作用研究。（4）在國內更多名貴養殖品種上展開研究。（5）探討甲殼素的其他衍生物，如稀土甲殼素、殼聚寡糖對水產動物免疫功能的影響作用。

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