脊髓損傷相關的microRNA研究進展①

陳建敏，楊拯，梁楠，張曉

·綜述·

脊髓損傷相關的microRNA研究進展①

陳建敏，楊拯，梁楠，張曉

脊髓損傷是一種嚴重的中樞神經系統創傷。MicroRNA(miRNA)是能夠抑制靶基因表達的小分子RNA，在脊髓發育和脊髓損傷等過程相關基因的調節中具有重要作用，可能是促進脊髓損傷后神經修復和再生的治療性干預新靶點。

脊髓損傷；microRNA；轉錄后基因調控；神經退行性變；綜述

[本文著錄格式]陳建敏，楊拯，梁楠，等.脊髓損傷相關的microRNA研究進展[J].中國康復理論與實踐,2013,19(7):635-639.

脊髓損傷是一種嚴重的中樞神經系統創傷，將導致損傷節段以下運動和感覺功能障礙。脊髓損傷后神經功能的恢復和重建是治療脊髓損傷的核心問題。MicroRNA(miRNA)是最近20年新發現的基因表達調節因子。研究表明，miRNA在脊髓的發育、脊髓可塑性和脊髓損傷后的病理改變中均發揮重要的調節作用，一些miRNA可能成為脊髓損傷后治療性干預的有效靶點[1-4]。本文主要介紹miRNA的生物起源、對基因表達調節的機制，綜述miRNA在脊髓發育、脊髓可塑性及脊髓損傷后的表達和作用機制，評述miRNAs作為脊髓損傷治療靶點的研究前景。

1 概述

miRNA是一類由20～25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，在轉錄后水平調節特定基因的表達。miRNA最早發現于線蟲(Ceаnorhаdbitiselegans)，這種內源性小分子RNA能夠通過RNA-RNA的相互作用調節特定蛋白的翻譯[5]。后續的研究證明，這種內源性小分子RNA能調節mRNA翻譯。miRNA基因序列轉錄后不會被翻譯為蛋白質，故miRNA是非編碼RNA家族(non-coding RNA family)的成員之一。近年來，miRNA的研究發展迅速，最新的miRBase(release16)已包含140個物種的15,000個miRNA的基因位點和超過17,000條不同的成熟miRNA序列[6]。大量的實驗證據表明，miRNAs作為基因表達的調控因子，在生物發育和疾病過程中具有十分重要的作用，miRNA已成為重大疾病發生機制和治療策略研究中不可缺少的研究對象。

1.1 生物發生

miRNA基因位于細胞核基因組中，大部分(約80%)miRNA由內含子區域編碼，并在RNA聚合酶Ⅱ作用下轉錄為較長的初級轉錄產物，稱為初級miRNA(primary microRNA, pri-RNA)。pri-RNA至少具有一個約70個核苷酸的發夾結構[7-8]。pri-RNA被由RNA酶Ⅲ和接頭蛋白Dorsha組成的核酸酶復合體剪切加工，形成前miRNA(precursor RNA,pre-RNA)，后者在細胞核蛋白Exportin 5的作用下被轉運至細胞質。pre-RNA在細胞質中被Dicer切割為約20～25個核苷酸組成的不完整雙鏈結構，此雙鏈由成熟的miRNA和它的互補鏈miRNA*組成。上述雙鏈中的一條鏈被降解，未被降解的那條即為成熟的miRNA。某些情況下，兩條鏈都可產生成熟miRNA。以miR-X:miR-X*表示雙鏈，其中星號標識的是非主要表達的轉錄產物。成熟的miRNA在接頭蛋白(如Argonaute蛋白，簡稱Ago蛋白)的輔助下與Dicer結合，形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)[8-12]。

1.2 作用機制

RISC中的成熟miRNA通過與靶mRNA中3'-UTR序列互補配對、結合，發揮調節基因表達的作用。miRNA 5'-端的第2～8個核苷酸對識別靶mRNA起決定性作用，被稱為“種子”(seeds)[13]。miRNA主要通過翻譯抑制或降解靶mRNA兩種機制在轉錄后水平調節基因的表達[14]；但在細胞周期阻滯時，miR-

miRNA對靶mRNA的作用機制與兩者結合區域的配對情況有關：當miRNA與靶mRNA互補程度較低時，主要引起mRNA的翻譯抑制；當miRNA與靶mRNA互補程度很高時，主要引起mRNA的降解。miRNA對翻譯的抑制作用是通過RISC中的Ago蛋白與mRNA上7-甲基化鳥苷酸帽子結構相互作用實現的。真核生物翻譯起始需要起始因子4E(initiation factor 4E,IF4E)與成熟mRNA 7-甲基化鳥苷酸帽結構直接相互作用[17]。當miRNA與mRNA 3'-UTR結合后，RISC復合物中的Ago蛋白與7-甲基化鳥苷酸帽結構相互作用，阻滯IF4E與mRNA結合，進而阻止翻譯起始[18]。關于miR-124及其靶mRNA的研究表明，miRNA所致的翻譯抑制與mRNA降解是相互聯系的[14]。翻譯抑制是miRNA調節的早期事件，進一步的mRNA降解可能加強mRNA沉默作用。最近的一項研究表明，mRNA降解可能是miRNA作用的主要機制[19]。

1.3 靶基因

由于miRNA與靶mRNA的識別僅需要部分序列的互補，所以一個miRNA分子可能有上百個靶mRNA；同樣，每個mRNA分子也可能受多個miRNA的調控。事實上，許多研究也證明，每個miRNA分子可調節數百個甚至更多靶mRNA[20]，每條mRNA可以受控于多個miRNA[21]。

生物信息學的巨大進步使科學家們能夠使用特殊的軟件和數據庫預測miRNA的靶mRNA，如TargetScan是一種在線的免費miRNA靶序列預測軟件。目前，這種預測是基于miRNA與mRNA的序列比對。在此基礎上，利用進化的保守性和結合位點的位阻等結構信息，可以進一步提高預測的準確性。包含已被實驗確認的靶序列的數據庫包括Tarbase、Ago和miRNAMAP等[7]。Li等最新綜述了關于miRNA靶序列預測和預測軟件的網絡資源等有關miRNA靶基因預測的主要問題[22]。

Kuhn等提出miRNA靶基因確定的4個標準：①miRNA/ mRNA相互作用必須得到實驗驗證；②miRNA與靶mRNA必須同時表達；③給予miRNA處理必須對蛋白表達產生預期的效應；④miRNA對靶基因表達的調節應該等同于其生物學功能[23]。靶序列預測工具的進步和實驗評價標準的建立，是miRNA靶基因研究必要的發展方面。

2 在脊髓發育和功能維持中的作用

2.1 脊髓發育過程中miRNA表達譜

miRNA是脊髓發育和可塑性的重要調節因子。已發現多種miRNA在脊髓中特異性表達或高豐度分布，并在脊髓發育中受到嚴格的調控[24-27]。

關于脊髓發育過程中miRNA的初期研究，很多是以高通量的方法探究脊髓發育過程中miRNA的表達變化[24-27]。這些研究結果證明，miRNA的差異性表達與脊髓發育的聯系，也為篩選和深入研究有重要調控意義的特異miRNA分子提供參考資料。可檢測553個非冗余miRNA的陣列分析平臺包括人和小鼠全套miRNA的檢測探針，能高效檢測各種組織miRNA的表達情況，獲得差異性表達信息[25]。利用微陣列分析(microarray analysis)、實時RT-PCR(real-time RT-PCR)和原位雜交(in situ hybridization)等技術，Bak等發現成年小鼠的脊髓、小腦和延髓等中樞神經系統組織中有44種miRNA較其他組織高3倍，這些中樞神經系統特有的高豐度miRNA可能與這些區域的特定功能相關[24]。這些中樞神經系統高豐度的miRNA與斑馬魚中的同種miRNA具有100%同源性，提示miRNA在進化中較保守，miRNA相關的基因調控方式在中樞神經系統中的作用機制可能也相對保守。

2.2 與脊髓發育相關的miRNA

后續的研究更加關注特定miRNA分子在脊髓發育中的作用和機制。神經元細胞的分化、細胞類型的維持和各類細胞的成簇組織是脊髓發育和功能建立的結構基礎，這些過程受到多種轉錄調節因子的控制，這些轉錄因子受到特定的miRNA調控。FoxP1是促使側索運動神經元(lateral motor neuron,LMN)亞型分化的轉錄因子，miR-9可調節FoxP1的表達，從而影響LMN的亞型分化[28]。實驗表明，過表達miR-9可導致雞脊髓中FoxP1的異常表達，后者能解除Lhx3和Hb9的抑制；過表達或敲除miR-9將改變發育中雞脊髓的運動神經元的亞型，改變神經束的同一性和軸突的相互作用[29]。另一種被證實具有影響脊髓神經元分化類型和束狀結構的miRNA是miR-17-3p。miR-17-3p通過影響轉錄因子Olig2的表達影響脊髓發育。Olig2和Irx3是一對相互影響的轉錄因子，它們分別是運動神經元祖細胞(pMN)和V2中間神經元祖細胞(p2)的特征性轉錄因子。Chen等發現，miRNA缺失的小鼠或僅miR-17～92簇缺失的小鼠，脊髓的pMN/p2邊界向背側移動，且不能產生V2中間神經元[30]。實驗證明，miR-17-3p通過使Olig2 mRNA發生基因沉默，抑制p2中Olig2的表達而影響交叉抑制的轉錄因子Olig2和Irx3間的平衡，最終影響脊髓背側祖細胞區域的分布方式。

miR-124是一種在神經系統中研究資料較多的miRNA，它在脊髓的含量高于非神經組織100倍，是一種中樞神經系統組織特異性的miRNA[27]。Farrell等研究miR-124與轉錄因子Sox9在脊髓發育中的相互作用，證明Sox9和miR-124在空間和時間上的調控關系，在脊髓發育過程中，miR-124以Sox9為靶分子影響脊髓的發育[31]。miR-124的另一個靶分子是小C端磷酸酶1(small C-terminal domain phosphatase 1,SCP1)[32]。SCP1是非神經組織中表達的抗神經分化因子，具有抑制神經元性基因表達的效應[33]。miR-124通過靶向SCP1 mRNA，促進神經元細胞的分化成熟[32]。

某些生物醫學模型和實驗誘導處理可用于研究脊髓發育的分子機制。蠑螈尾部截斷后的重生及脊髓功能的重建是一種研究脊髓發育分子機制的良好生物醫學模型。Sehm等在蠑螈尾部再生過程中發現78種高度保守的miRNA在尾部再生早期階段表達顯著變化；其中miR-196顯著上調，而抑制miR-196的表達將導致再生障礙，產生異常的短尾和脊髓功能缺陷[34]。進一步實驗還證實了miR-196途徑中miR-196的下游組分還包括脊髓中的組織類型調節因子，包括BMP4和Pax7。采用實驗處理誘導脊髓發育異?？勺鳛榧顾璋l育分子機制的良好研究對象。通過向孕鼠定期投喂視黃酸可導致胚胎脊髓發育異常，在此過程中表達發生變化的miRNA可能在脊髓發育中具有調控作用。實驗發現了miR-9、miR-9*、miR-124a和miR-125b在視黃酸誘導的脊柱裂胚胎中顯著下降，提示這些miRNA可能參與了脊髓發育調控[35]。

很多研究支持組織特異性的miRNAs參與建立和維持特定細胞表型的蛋白表達譜。研究脊髓發育過程中miRNA表達譜及組織特異性miRNA是探討脊髓發育和功能建立的重要問題，可以為脊髓損傷后功能重建的治療性干預提供新的治療靶點和策略思路。

2.3 miRNA與脊髓中非神經元細胞的分化發育

miRNA對脊髓中非神經元細胞的分化發育也具有調節作用。

小膠質細胞是定居在中樞神經系統的免疫細胞，其來源尚未完全闡明，骨髓來源的髓系細胞是小膠質細胞的主要起源。小膠質細胞的分化和激活是細胞對中樞神經系統相應微環境適應性變化的結果，miRNA是其中重要的調控分子[8]。培養的少突膠質細胞從祖細胞向成髓鞘前體細胞分化過程中，有43種miRNA表達顯著變化[36]；其中，miR-9在少突膠質細胞分化過程中顯著下調；miR-9的表達水平與它的預測靶分子負相關，這些預測的靶分子包括外周髓鞘蛋白22(peripheral myelin protein 22,PMP22)。在少突膠質細胞中可檢測到PMP22 mRNA，但檢測不到PMP22蛋白，而產生PMP22蛋白的施萬細胞缺少miR-9，推測miR-9可能通過抑制mRNA翻譯調節PMP22的表達水平。miR-219和miR-338是少突膠質細胞特異性的miRNA。這兩種miRNA促進培養的少突膠質細胞前體細胞成熟，過表達miR-219和miR-338即可促進少突膠質細胞的分化。斑馬魚在體實驗表明，下調miR-219也影響少突膠質細胞的成熟。miR-219和miR-338對少突膠質細胞分化的促進功能一部分是通過直接抑制少突膠質細胞分化的負調控因子產生的，這些負調控因子包括轉錄因子Sox6和Hes5[37]。

miR-7a是少突膠質細胞前體細胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)高表達的miRNA之一。過表達和功能抑制實驗證明，miR-7a具有促進OPCs和神經元祖細胞(neural progenitor cells,NPCs)分化為少突膠質細胞的作用[38]。miR-7a促少突膠質細胞分化成熟的作用靶分子有神經元前體分化因子(proneuronal differentiation factors,如Pax6和NeuroD4)或參與少突膠質細胞成熟的前少突膠質細胞(pro-oligodendrocyte,proOL)分化調節因子，如Spl。

miR-124也是小膠質細胞分化成熟過程中的調節分子。與在神經元中不同，miR-124在小膠質細胞中的靶分子是影響髓細胞發育的轉錄因子CEBPα[39]。miR-124除了對小膠質細胞分化具有調節作用，還被發現在炎癥等病理條件下導致的小膠質細胞激活過程中亦有作用，但作用機制尚未完全闡明。

3 在脊髓損傷病理機制中的作用

脊髓損傷所引發的病理生理變化，如細胞凋亡、炎癥、星形膠質細胞增生等，也受特定基因表達的嚴密調控。miRNA是其中的重要調控分子，成為促進修復和再生的治療性干預的新靶點。目前關于脊髓損傷后miRNA的表達變化和特定miRNA分子的作用報道尚不豐富。

3.1 miRNAs的表達改變

脊髓損傷后miRNAs的變化可分為3個類型：上調、下調、早期(4 h)上調后1～7 d下調。生物信息學分析表明，脊髓損傷后發生變化的miRNA，可能靶基因包括編碼炎癥、氧化應激和凋亡等過程中組分的基因，這些過程被認為在脊髓損傷病理機制中具有重要作用。這些發現表明，miRNAs的異常表達可能在脊髓損傷病理機制中具有作用，并且可能是脊髓損傷后治療性干預的潛在靶點[4]。

大鼠脊髓損傷后表達下調的miRNA數量顯著增加，同時出現相應mRNA的上調。生物信息學分析揭示這些變化的miRNA影響脊髓損傷病理生理學關鍵過程，包括炎癥和凋亡[1]。脊髓損傷后上調的miRNA有32種，包括miR-124、miR-129和miR-1[3]。其中miR-129-2和miR-146a表達的變化與起始損傷的嚴重程度有關，提示這些miRNA可作為脊髓損傷的生物標記和治療靶點。這些miRNA的表達模式與SOX2、nestin和REST在時間和空間上的出現一致，表明這些miRNA不僅反映干細胞小生境的出現，也反映損傷后存活的神經元細胞再次出現前神經元表型。生物信息學分析這些miRNA的靶基因，顯示這些miRNA的調節異常與凋亡和細胞周期異常等二次損傷發病機制相關過程的聯系[3]。

3.2 miRNAs在脊髓損傷中的作用

通過miRNA表達譜的分析已發現在脊髓損傷后表達顯著改變的miRNAs，它們的作用機制已有初步的研究，包括miR-124a、miR-20a、miR-486和miR-133b等。

小鼠脊髓損傷后1～7 d，miR-124a表達顯著下降，下調表達的時間進程可能反映細胞死亡[40]。

miR-20a是脊髓損傷后上調的miRNA，與運動神經元退化有關。抑制miR-20a表達能有效誘導運動神經元存活和神經發生，其關鍵的靶基因為神經原質蛋白1(neurogenin 1,Ngn1)[41]。

miR-486與脊髓損傷后氧化性損傷相互關聯。miR-486通過與NeuroD6 mRNA編碼區一段保守序列作用，抑制NeuroD6的表達。在運動神經元中，NeuroD6與促進活性氧自由基清除的類硫氧還蛋白1(thioredoxin-like 1)和谷胱甘肽過氧化物酶3 (glutathione peroxidase 3)的調節區域結合，促進它們的表達。敲出miR-486基因和在損傷部位注入NeuroD6的實驗證明了miR-486在脊髓損傷氧化性損傷中的作用，并具有促進小鼠運動功能恢復的效應。因此，miR-486可能成為脊髓損傷治療的新靶點[2]。

miR-133b在斑馬魚脊髓橫斷后對運動功能恢復和神經再生具有正效應，其作用通過負調控一種小GTP酶RhoA蛋白水平實現[42]。RhoA作為脊髓損傷治療靶點已有研究，miR-133b對RhoA的內源性調控，對這一治療靶點的應用提供了新的手段。

定量PCR顯示，脊髓損傷后12 h出現miR-223的高表達。原位雜交和免疫組化雙染色表明，miR-223的雜交信號與Gr-1陽性的嗜中性粒細胞相結合，表明miR-223可能在脊髓損傷后早期調節嗜中性粒細胞的行為[43]。

膠質細胞改變所產生的后果也是脊髓損傷的主要病理機制，包括脫髓鞘和膠質化兩種主要的病理過程。脫髓鞘是脊髓損傷后神經傳導功能異常的原因之一，少突膠質細胞在髓鞘的產生和維持中具有十分重要的作用，這些細胞可能成為干預脫髓鞘造成的感覺和運動功能喪失潛力巨大的靶點。從人類胚胎干細胞到少突膠質細胞的成熟過程中，miRNA的表達模式及其靶分子的預測顯示，miRNA在少突膠質細胞分化過程中起調控作用[44]。

有關脊髓損傷后脫髓鞘相關的miRNA變化和作用目前未見報道。對自身免疫性脫髓鞘時CD4+T細胞miRNA表達譜的研究發現，miR-301a在髓磷脂激活的CD4+T細胞中顯著上調，它直接調控信號轉導子和轉錄激活子(signal transducer and activators of transcription,STAT)抑制因子(protein inhibitor of activated STAT,PIAS)3的表達，后者通過白細胞介素(IL)-6/23-STAT3信號通路影響CD4+T細胞的分化，進而參與脫髓鞘相關的病理過程[45]。

膠質化是脊髓損傷后神經束再生和功能重建的主要障礙。脊髓損傷后膠質化涉及有益的早期過度增生反應和隨后的致密疤痕的形成。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信號通過對星形膠質細胞中miR-21的調控影響瘢痕的形成。在野生型剝奪血清的星形膠質細胞中過表達miR-21，會導致細胞體積顯著縮小，同時伴隨膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAF)水平的下降。通過BMP信號調節miR-21，可能提供控制神經膠質過多癥和增強脊髓損傷后功能恢復的一種新方法[46]。

脊髓損傷帶來巨大的損傷。目前，缺乏促使損傷部位再生的有效治療措施，對脊髓損傷后病理損傷和脊髓可塑性機制的了解十分有限。脊髓損傷治療的核心問題是減輕二次損傷和促進功能重建。減輕二次損傷必須了解損傷后病理過程的分子機制，miRNA在其中的變化可能成為新的治療靶點。miRNA對脊髓發育過程中的調控作用及對脊髓可塑性的操控，對促進功能再生治療策略的制定具有重要的指導意義。

目前，關于脊髓損傷后miRNA研究的資料較少，研究內容不夠深入，研究資料相對零散，缺乏分子機制之間的相互聯系；以miRNA表達譜研究和特殊miRNA在脊髓損傷中的效應研究居多，缺乏對特定miRNA作用分子機制的詳細研究，對特定miRNA分子調控的上下游分子及所涉及的信號通路未深入研究，因而更無法揭示各種miRNAs形成的調節網絡在脊髓損傷中的調控模式。脊髓損傷中miRNA研究有待深入開展，各種miRNA的作用機制和相互聯系是今后研究的重要方向。這將提高人們對脊髓損傷后miRNA調控作用的認知水平，并促進基于miRNA調控的脊髓損傷治療措施的發展。

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Advance in MicroRNA Related with Spinal Cord Injury(review)

CHEN Jiаn-min,YANG Zheng,LIANG Nаn,et аl.Experimentаl Center for Bаsic Medicаl Teаching,the School of Bаsic Medicаl Science,Chengdu Medicаl College,Chengdu 610500,Sichuаn,Chinа

Spinal cord injury(SCI)is a kind of severe central nervous system trauma causing motion and/or sensation dysfunction.MicroRNAs are short non-coding RNAs that suppress the translation of target genes,and play an important role in gene regulation involved in spinal cord development and SCI,which constitute novel targets for therapeutic intervention to promote repair and regeneration.

spinal cord injury;microRNA;posttranscriptional gene regulation;neurodegeneration;review

R681.2

A

1006-9771(2013)07-0635-05

四川省科技廳項目(No.2008SZ0053)。NAs也表現出激活翻譯的作用[15-16]。

2012-09-21)

成都醫學院基礎醫學實驗教學中心，四川成都市610500。作者簡介：陳建敏(1980-)，女，漢族，四川成都市人，碩士，博士研究生，講師，主要研究方向：脊髓損傷與修復的分子機制。通訊作者：張曉(1959-)，男，漢族，廣東惠陽市人，博士，教授，主要研究方向：脊髓損傷與修復治療。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.07.011