腰椎間盤退變基因治療的研究進展

李 翔，李新志

腰椎間盤退變 (LDD)是引起一系列脊柱疾病的主要原因，但現有的保守治療及手術治療均是針對患者臨床癥狀［1］，并不真正符合LDD的發病機制及病理生理學特點。為尋求更好的治療方法，基因治療逐漸進入人們的視線并成為近些年研究的熱點。LDD基因治療主要涉及目的基因的篩選、載體的選擇、轉染方法和轉基因的表達調控等，現就其研究進展綜述如下。

1 基因治療的必要性

LDD是由基因因素和環境因素相互作用的多因素疾病。Battié等［2－3］對不同環境下成長的同卵雙胞胎進行的長期研究顯示，LDD可能主要受遺傳因素的影響，環境因素的影響可能非常有限。Patel等［4］通過人口數據庫系統對猶他州的1 264例LDD患者進行健康和家譜分析，發現LDD患者有明顯的家族聚集性。Kepler等［5］認為許多特定的遺傳風險基因與LDD密切相關，個人發生LDD風險的75%可歸因于遺傳因素。傳統觀點認為基因治療主要針對的是經典遺傳性疾病，但基因治療技術的進步揭示了其在后天獲得性慢性疾病中的潛在用途。由LDD引發的腰椎疾病也是基因治療的良好適應證［6］。基因治療的主要方法是利用載體將治療性基因轉染到靶細胞內，轉基因細胞就會持續產生治療所需的產物。雖然基因治療的技術要求復雜，但一旦成熟應用于臨床，可以想象，一次基因或蛋白因子注射會給患者帶來多么大的好處。

2 目的基因

對于基因治療而言，找到與疾病發生發展密切相關的目的基因是關鍵問題。目前，常用候選基因的方法來識別與LDD相關的目的基因，并發揮了一定的作用。目前研究熱門的候選基因主要有以下幾種。

2.1 細胞外基質蛋白 (ASPN)基因

ASPN基因因與骨關節炎相關而成為LDD的候選基因。Song等［7］應用微點陣和原位雜交技術對中國和日本LDD隊列進行了研究，發現ASPN基因的表達隨年齡增長和腰椎間盤的退變而升高，其中D14基因型占多數，且與LDD具有高度相關性。薈萃分析結果顯示，在兩個隊列中，個人攜帶至少一個D14等位基因發生LDD風險的比值比分別為1.66和1.79，表明東亞人群ASPN基因與LDD密切相關。

2.2 軟骨中間層蛋白 (CILP)基因

CILP是關節軟骨的重要結構，與骨關節炎密切相關。Wang等［8］利用兔子腰椎退變動物模型對CILP基因在腰椎間盤組織中的表達和表達調節機制進行研究表明，正常情況下CILP基因在兔子腰椎間盤組織中高表達，其表達水平隨兔齡增長及腰椎間盤的退變程度加重而持續上調;骨形態發生蛋白 －2(BMP－2)通過激發CILP基因啟動子的活性誘導CILP的表達，并且兔齡越大誘導作用越強。用基因干擾技術對表達Smad1蛋白的基因進行敲除，則BMP－2對CILP的誘導作用消失。據此推測，LDD程度、年齡和BMP－2均能對 CILP基因的表達進行調節，而BMP－2對CILP表達的調節作用則通過激活Smad1信號通路來實現，探討基因表達的調節機制也是研究LDD基因治療的重要方向。

2.3 骨形態發生蛋白 (BMP)基因

BMP是一種多功能生長因子，是具有成骨誘導作用的特殊蛋白質，可以刺激間充質干細胞分化為多種細胞。BMP家族成員眾多，目前研究較多的是BMP－2基因。Leckie等［9］采取穿刺造模并體內注射的方法，以2型腺病毒相關病毒為載體并裝載BMP－2基因，對兔腰椎間盤細胞進行轉染，并將其作為治療組，另設空白對照組;通過MRI檢查和組織學檢查證明兩組兔子均因穿刺而造成LDD，在12周時，治療組腰椎間盤內Ⅱ型膠原含量迅速增加，組織學形態也得到恢復，而對照組卻無此現象。提示BMP－2基因治療或許可作為LDD的一種治療手段。

2.4 生長分化因子－5(GDF－5)基因

既往研究認為GDF－5基因與骨骼的生長發育有關，但近年研究發現其與骨骼高度及膝骨關節炎密切相關［10］，因而成為了LDD的候選基因。Williams等［11］對北歐人群進行的大樣本量薈萃分析結果證實，含GDF－5 T等位基因的北歐女性更容易發生腰椎間隙變窄和骨贅，與LDD密切相關。Liang等［12］利用腺病毒作為載體，將分別搭載了 GDF－5基因 (治療組)和熒光素酶基因 (對照組)的腺病毒注射到LDD小鼠腰椎間盤，2周后，治療組小鼠的椎間高度持續增加，組織學檢查結果顯示治療組小鼠腰椎間盤的組織學結構明顯改善，而對照組無明顯改善。提示GDF－5基因可能是恢復退變腰椎間盤功能的候選基因。

3 載體

通常情況下，外源性基因很難被靶細胞所接受，這就需要載體把治療性基因轉導入靶細胞內，載體一般分兩種，即病毒性載體和非病毒性載體。

3.1 病毒性載體 病毒是非常高效的載體，因此，在進行基因治療研究時通常選用病毒作為載體，如慢病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒 (AAV)等。雖然研究表明此類載體基本上是安全的，但人們還是對其表示擔憂。

3.1.1 慢病毒載體 慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒 (HIV－1)為基礎的基因治療載體，目前研究較多［13］。HIV－1型慢病毒載體具有容納較大外源性基因片段、可瞬時表達、相關指標便于檢測、表達穩定、轉基因細胞株方便通過抗生素篩選等優點，且引起宿主的免疫反應小，安全性較好。胡明等［14］利用慢病毒為載體將干擾片段 (siRNA)轉染人胚腰椎間盤髓核細胞，并使髓核細胞的上皮膜蛋白－1基因表達沉默，成功構建了人胚腰椎間盤髓核上皮膜蛋白－1基因低表達細胞模型。

3.1.2 腺病毒載體 腺病毒載體是目前在轉基因研究領域應用較廣的病毒載體之一。Liang等［12］通過體內針刺注射的辦法將分別搭載了熒光素酶基因和GDF－5基因的腺病毒載體注射到小鼠腰椎間盤，然后分別在1、2、4、8周后處死小鼠并進行腰椎間盤組織學和生化檢測;結果顯示，腺病毒存活且能高效地向腰椎間盤細胞內轉導目的基因，轉基因表達持續6周以上。表明腺病毒可能是LDD基因治療的合適載體。

3.1.3 AAV載體 研究認為，AAV載體較腺病毒載體具有更少的免疫原性，目前為止仍未發現其與人類或哺乳動物的任何疾病有關，且AAV載體的大小可根據搭載基因的性狀進行調節。Lattermann等［15］將攜帶不同標記基因的AAV載體注射到24只兔子腰椎間盤組織，并對轉基因的表達及機體對AAV載體的細胞體液免疫進行評估，結果顯示，AAV載體能高效地轉導腰椎間盤細胞并產生了很好的轉基因表達作用，即使是在一個低水平的體液免疫環境下，總轉基因效率約相當于腺病毒載體的50%。出于人們對腺病毒載體安全問題的擔憂，AAV載體可能是更好的病毒性載體。

3.2 非病毒性載體 非病毒性載體介導的基因轉染技術較病毒性載體更為安全、簡單［16］，但非病毒性載體的轉染率較病毒性載體低，而超聲微泡技術及脂質體技術等的出現極大地提高了非病毒性載體的轉染率。

3.2.1 超聲微泡技術 超聲微泡技術是近年應用于基因治療的非病毒性載體技術之一，其利用超聲微泡造影劑攜帶藥物或外源性基因進入靶點，再在超聲環境下使其破裂并釋放藥物或基因。Nishida等［17］將分別加載了綠色熒光蛋白 (GFP)和熒光素酶的質粒與超聲微泡造影劑混合，注入SD大鼠腰椎間盤后將超聲施加于注射部位 (超聲組)，同時設置空白對照組，于1、3、6、12、24周后處死大鼠，將切下的髓核組織用于轉基因評估，以正常腰椎間盤組織作對照;結果顯示，基因轉染7 d后就能在GFP轉染的髓核觀察到相當數量的GFP陽性細胞，超聲組熒光素酶活性約是空白對照組的11倍，且該方法介導的轉基因表達至少持續24周。Nishida等［17］進行的研究也是第一次以非病毒性載體在體內進行轉染腰椎間盤細胞的報道，說明超聲微泡技術在LDD基因治療中具有很大的潛在作用。

3.2.2 脂質體 脂質體是近年應用較多的非病毒性載體，其主要成分是磷脂，與細胞膜中的天然脂質膜具有非常相似的生物學特性［18］。脂質體具有良好的生物相容性、生物降解性，且無免疫原性，是一種對受體細胞無明顯毒性的人工組裝囊泡。脂質體制劑對人體的安全性已獲得美國食品藥品監督管理局的認同。Morrey等［19］對多種脂質體相關載體進行了篩選，通過對它們在體外對腰椎間盤的細胞毒性、轉染率以及適宜轉染條件進行觀察發現，脂質體與蛋白質和多胺復合體(TransIT－LT1)可能是LDD基因治療比較好的非病毒性載體。

4 RNA干擾 (RNAi)技術

腰椎間盤是體內最大的無血管組織，其髓核被密封在兩端為終板軟骨、四周為致密纖維環的“密閉”空間。腰椎間盤營養物質和氧的供給主要通過終板軟骨被動擴散，這導致了髓核組織營養物質和氧的匱乏，尤其是腰椎間盤中心［20］，氧分壓低而乳酸含量高。因此，耗能少和需要營養物質少的治療方法也許更適合LDD的治療。近年來出現的針對特定基因并使其表達沉默的RNAi技術能使處于退化狀態的腰椎間盤相關基因表達下調，從而阻止腰椎間盤的退行性變。RNAi技術更注重預防腰椎間盤的退變，理論上講，還可以逆轉腰椎間盤的退變進程［6］。RNAi技術作為一種重要的防治手段已被廣泛應用于抑制特異基因的表達及其功能的研究［21］。Kakutani等［22］第一次用人類和大鼠髓核細胞做離體試驗，成功地沉默了SD大鼠和脊柱側凸個體髓核細胞中的靶基因。Seki等［23］通過體外轉染及體內注射，利用對解整合素－金屬蛋白酶－5(ADAMTS－5)特異的siRNA轉染兔髓核細胞，結果顯示兩種方式都有效地沉默了兔髓核細胞 ADAMTS－5基因。張濤等［24］采用RNAi技術成功地沉默了大鼠腰椎間盤髓核細胞的P53及P21基因，很大程度上改善并延緩了大鼠腰椎間盤組織的退變進程。RNAi技術作為一種新型的防治LDD的基因治療手段，可以有效地抑制髓核細胞特定基因的表達，還可用以探索特定基因的作用及基因間的相互關系。

5 小結

隨著生物技術的發展，基因治療LDD將會是未來的方向，且當前研究也取得了令人矚目的成就，但大多研究仍停留于動物實驗，真正應用于臨床還有許多困難要克服:(1)腰椎間盤是人體內最大的無血管組織，營養物質及氧供應非常有限，尤其是腰椎間盤中心［20］，造成腰椎間盤再生困難。從理論上說，腰椎間盤只能支持少量能耗高的代謝活躍細胞，而促進其再生和刺激細胞外基質合成的方法則不容易成功。(2)LDD的發病機制和腰腿痛機制仍未完全闡明，有待進一步深入研究，進而選擇最佳目的基因。 (3)基因治療的安全性及遠期效果也有待于進一步深入研究。期望未來幾年基因治療相關的研究會出現新突破，從而為LDD的基因治療提供更加安全可靠的方法。

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