應用HPLC-ICP-MS法同時測定富硒大蒜中砷的形態

陳晞，何桂華，韓煥美，鄭新華，張愛霞

（1.濟南出入境檢驗檢疫局，山東濟南250014；2.山東大學化學與化工學院，山東濟南250014）

硒是人體必需的微量元素，對預防疾病、增進健康和防止衰老具有重要意義，被譽為“生命的保護劑”[1]。由于富硒蔬菜具有高產量、高附加值的優勢，且植物源性有機態硒更安全、更有效，是人體攝入硒的最有益途徑，因此富硒蔬菜成為目前蔬菜產品開發的熱點[2]。然而，富硒地區土壤常伴生重金屬污染，作物吸收一定濃度硒元素的同時會加劇對重金屬元素的富集，嚴重影響蔬菜產品質量安全[3]。

砷元素是重金屬主要污染物之一，各種砷化物毒性與其形態密切相關，無機砷（As（Ⅲ）和As（V））毒性最強，有機態的一甲基砷、二甲基砷等毒性較低，砷糖、砷膽堿等有機砷類無毒。大蒜是對硒元素有較強的富集作用，其硒含量約為其他蔬菜的10 倍左右，通過攝入富硒大蒜可有效改善人體缺硒狀況。在大蒜種植過程中施加硒元素可提高砷元素的轉移效率，增加砷元素在大蒜中的含量，影響產品質量安全。因此，準確檢測富硒大蒜中的無機砷含量對提高富硒大蒜產品質量具有重要指導意義，對我國制訂富硒蔬菜產品生產規范提供了檢測依據。課題組在前期工作基礎上，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICP-MS）聯用技術測定了富硒大蒜中五種砷的形態，分離效果和定量結果均令人滿意。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

富硒大蒜：超市采購，產地分別為濟南、濰坊、萊蕪；砷酸根（32.4 μmol/g）、亞砷酸根（124.3 μmol/g）、一甲基砷（46.2 μmol/g）、二甲基砷（0.706 μmol/g）、砷甜菜堿標液（0.518 μmol/g）：中國計量科學研究院；硝酸銨、磷酸氫二銨：國產優級純。實驗用水為Millipore 超純水機制備的超純水，符合GB 6682-1992《分析實驗室用水規格和試驗方法》所規定的一級水標準。

1.2 儀器與設備

7500cx 電感耦合等離子體質譜儀、1200 高效液相色譜：美國安捷倫公司；高速冷凍離心機：日本日立公司；刀式研磨儀：德國萊馳公司；恒溫水浴搖床：美國熱電公司；精密酸度計：上海雷磁儀器廠；AL104 分析天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 前處理方法

取富硒大蒜可食部分，使用刀式研磨儀粉碎均勻。準確稱取2.00 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 超純水，渦流混勻，超聲萃取40 min，于4 ℃下轉速8 000 r/min 冷凍離心15 min，上清液過0.45 μm 水相濾膜上機測定。同時進行試劑空白試驗。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Dionex IonPac As11 陰離子色譜分析柱（含保護柱）；流動相：5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液+10 mmol/L硝酸銨溶液（氨水調節pH 為9.2）；流速1.0 mL/min；進樣量40 μL。

1.3.3 ICP-MS 條件

RF 功率：1 600 W；載氣流速：15 L/min；輔助氣流速：1 L/min；霧化氣流速：1 L/min；蠕動泵轉速：0.3 r/min；采樣深度：8.0mm；提取透鏡：-120V；Omega 透鏡：-16V。

1.3.4 標準工作溶液配制

分別用超純水將砷甜菜堿、一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亞砷酸根的標準儲備溶液逐級稀釋，配制成0、1.0、10.0、20.0、50.00 和100.0 ng/mL 的砷形態混合標準系列，超純水為標準空白。采集空白及標準溶液系列，計算各色譜峰的積分面積，繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

常見砷形態的離解常數pKа 分別為：亞砷酸根（As（III））：9.2；砷酸根（As（V））：2.3、6.8、11.6；一甲基砷酸（MMA）：2.6、8.2；二甲基砷酸（DMA）：6.2；砷甜菜堿（AsB）：2.2。由此可見各形態均可電離成離子態，且各形態解離常數差別較大，故可選用陰離子色譜柱分析。

磷酸鹽作為常用陰離子淋洗液，作為無機砷的基礎淋洗液較為合適。考慮到與鈉鹽相比，銨鹽對ICPMS 采樣錐和截取錐的傷害更小，故選擇磷酸氫二銨作為基礎淋洗液。大蒜樣品中氯化物含量較高，加入硝酸銨可以改變氯離子的出峰時間，避免氯化物對As測定的干擾；同時，硝酸銨也可改善As（V）的保留時間。有文獻表明在加入甲醇或乙醇后As 測定的靈敏度可增高[4]，但實驗發現，有機試劑的加入對陰離子柱和ICP-MS 的炬管、采樣錐壽命均有明顯影響，導致檢測成本過高。經優化，最終選擇5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液+10 mmol/L 硝酸銨溶液（氨水調節pH 為9.2）作為流動相。為提高檢測靈敏度，將進樣量增大到40 μL。

圖1 為流動相流速1.0 ml/min 時5 種砷形態標準品（50 μg/L）分離的色譜圖（a）和大蒜樣品測量譜圖（b）。由圖1 可知，5 種形態砷完全基線分離，峰型對稱、尖銳，保留時間穩定，可以滿足實際樣品檢測需要。

圖1 5 種砷形態標準溶液色譜圖（a）和大蒜樣品測量譜圖（b）Fig.1 Chromatogram of five arsenic species（a）and of the garlic sample

2.2 ICP-MS 條件優化

考慮到砷的電離能較高，將RF 功率適當增高至1 600 W，保證砷的各形態均可完全解離以滿足測定要求。因聯機后流動相流速達1.0 mL/min，為避免廢液不能及時排出對儀器造成損壞，將蠕動泵轉速提高至0.3 r/min。聯機前，使用1.0 mg/L 的Li、Y、Co、Ce、Tl 混合調諧液對ICP-MS 進行調諧，調整載氣流速、采樣深度、炬管位置、透鏡參數等指標，以保證儀器的最佳狀態和儀器狀態的穩定性。調諧后，儀器靈敏度明顯提高，中質量數（Y）>500 Mcps/ppm，同時使氧化物CeO/Ce<3%，雙電荷產率Ce2+/Ce+<1.5%。

2.3 提取條件優化

試驗比較了鹽酸提取、沸水提取、超聲提取3 種處理方式的提取效果。結果表明，鹽酸提取液氯離子濃度過高，解離后出現極寬的干擾峰，造成標準品峰形無法分辨，基線漂移漂移嚴重，無法達到定量分析的要求，故不采用該方式提取。

圖2 為沸水提取（a）和超聲萃取（b）時提取時間對5 種砷形態回收率的影響。

圖2 沸水提取（a）和超聲萃取（b）時提取時間對5 種砷形態回收率的影響Fig.2 Effect of the time on the recoveries of 5 arsenic species with extraction of boiling water（a）and ultrasonic（b）

由圖2 可見，沸水提取時，提取效率與時間密切相關，短時間內砷酸根和亞砷酸根的提取效率隨時間延長而提高，但時間延長至40 min 左右時，部分亞砷酸根氧化為砷酸根，回收率反而降低，該方法耗時長、無機砷回收不穩定，有機砷回收率也不高，需進一步優化。超聲萃取具有耗時短、樣品無交叉污染，適合批量樣品測定，經加標回收實驗，超聲萃取40 min，5 種形態的砷回收率均在90%以上，滿足檢測需要。

2.4 工作曲線和方法檢出限

對濃度分別為0、1.0，10.0、20.0、50.00、100.0 ng/mL的砷形態混合標準溶液進行HPLC-ICP-Ms 分析，以峰面積對濃度進行線性回歸。結果表明，在該濃度范圍內，5 種砷形態的線性回歸方程相關系數均在0.999以上。對標準溶液進行逐級稀釋，以10 倍信噪比（S/N）作為定量檢出限。線性回歸方程、相關系數及檢出限見表1。

表1 5 種砷形態的線性回歸方程及相關系數（r2）Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 arsenic species

2.5 回收率與精密度

選取市售富硒大蒜，采用微波消解-ICP-MS 法測定其總砷含量，選擇總砷含量為未檢出者作為空白樣品進行加標回收試驗。取空白的富硒大蒜樣品可食部分，使用刀式研磨儀粉碎均勻。準確稱取2.00 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL 離心管中，分別加入0.50、1.0、50.0 μg/kg 5 種形態砷混合標準溶液，加入20 mL 超純水，渦流混勻，超聲萃取40 min，于4 ℃下轉速8 000 r/min 冷凍離心15 min，上清液過0.45 μm 水相濾膜上機，測定并計算回收率和精密度（n=6）。測得平均回收率范圍在89.5%～108.2%之間，相對標準偏差在0.68%～4.2%之間（見表2）。空白大蒜樣品（a）和加標大蒜樣品（b）的HPLC-ICP-MS 色譜圖見圖3，加標濃度50 μg/kg。

表2 5 種形態砷標液的添加回收率和精密度（n=6）Table 2 Spiked recoveries and precisions for 5 arsenic species（n=6）

圖3 空白樣品（a）和加標樣品（b）的HPLC-ICP-MS 色譜圖Fig.3 HPLC-ICP-MS chromatograms of the blank sample（a）and the sample spiked with 5 arsenic species（b）

2.6 市售富硒大蒜樣品檢測

選購市售富硒大蒜樣品，按所建立的HPLC-ICPMS 方法測定5 種砷的形態，同時測定總砷含量，結果見表3。

表3 市售富硒大蒜檢測結果Table 3 Analytical results of selenium-enriched garlic μg/kg

結果表明，富硒大蒜中的砷元素主要以MMA 形態存在，另有少量五價砷。研究表明，一甲基砷酸毒性與As（III）和As（V）相比更低，較二甲基砷、砷糖、砷膽堿毒性更高[5]。總砷含量比5 種形態砷元素檢測結果總和略高，應是無毒的砷糖、砷膽堿類存在。所測富硒大蒜中總砷含量均很低，遠低于GB 2762-2012《食品安全國家標準食品中污染物限量》所規定的總砷≤0.5 mg/kg。這與富硒蔬菜種植一般采用基地管理，對土壤、灌溉水、肥料中重金屬含量進行嚴格控制密切相關。

3 結語

富硒大蒜經超聲萃取后，采用液相色譜分離后利用電感耦合等離子體質譜測定樣品中5 種砷的形態。該方法操作方便，準確度與精密度均可滿足檢測需要。經檢測，市售富硒大蒜中砷的含量普遍較低，主要以低毒性的一甲基砷形態存在。

[1] 于紅陽,楊改霞,黃培新．大骨節病自然消長與硒元素關系的研究[J].中國地方病學雜志,1999,18(3):200

[2] 黃凱豐,時政,馮健瑛.富硒蔬菜的研究現狀[J].長江蔬菜,2011(10):14-17

[3] 陳海珍,陳志澄,劉士哲.硒與砷在植物中相互作用的實驗研究[J].農業環境保護,2001,20(2):91-93

[4] 林立,陳光,陳育紅.液相色譜一電感耦合等離子體質譜法聯用測定白酒中的無機砷[J].環境化學,2008,27(6):853-855

[5] 李冰,陸春偉,孫貴范.不同砷化合物對血管內皮細胞毒性的研究[J].衛生研究,2006,35(6):700-702