雙歧桿菌的脂磷壁酸激活巨噬細胞產生TNF-α的信號通路

黃國珍 陳偉布 李麗梅 黃新民

1.深圳市坪山新區人民醫院，廣東深圳 518118；2.深圳市人民醫院檢驗科，廣東深圳 518001

黏附于動物腸道內最主要的細菌就是雙歧桿菌。雙歧桿菌是機體內的正常細菌，它們的存在對維持機體腸道內菌種生態平衡有重要的促進作用。脂磷壁酸是革蘭陽性菌細胞壁內的重要大分子。有研究表明，脂磷壁酸能結合至巨噬細胞表面，激活巨噬細胞許多信號通路，分泌許多重要細胞因子[1]，從而對巨噬細胞的吞噬能力產生促進作用[2]。本研究探討了雙歧桿菌的脂磷壁酸對巨噬細胞產生腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的激活作用。

1 材料與方法

1.1 材料

7～10 周齡的Bal/c小鼠20只，其中，雄性10只，雌性10只，體重20～25 g。人體淋巴癌細胞傳代于100 ml的胎牛血清培養液中，當它們貼壁生長成單層時，用胰蛋白酶消化[3]。TNF-α檢測試劑盒為Sigma公司生產，細胞裂解液購自Bio-Rad公司，蛋白酶抑制劑購自Signalling公司。

1.2 方法

1.2.1 脂磷壁酸的提取 將雙歧桿菌接種于LB培養基中，在 37℃無氧環境中培養 48 h。用離心機（12 000×g，15 min）收集細菌。將細菌置入裂解液中，裂解10min，離心機（12000×g，15 min）收集上清液。將上清液置入50℃的水浴鍋中水浴20 min，當溶液分成上下兩層時，結束水浴。將上層溶液放入陰離子層析器中，再用醋酸銨緩沖溶液洗脫，此時脂磷壁酸吸附在洗脫柱上。將脂磷壁酸溶于緩沖液中，用分光光度計進行檢測，無明顯的核酸和蛋白質污染時，可以進行下一步實驗[4]。

1.2.2 具體方法 將20只小鼠隨機分成脂磷壁酸組（10只）和對照組（10只）。兩組小鼠的性別、體重等方面差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。脂磷壁酸組小鼠每天空腹注射脂磷壁酸溶液（10 g/L）3 ml，對照組小鼠每天空腹注射緩沖溶液3 ml，兩組均連續注射10 d。

1.2.3 巨噬細胞的提取和培養 10 d后將20只小鼠全部處死，提取小鼠腹腔液，用離心機（12 000×g，5 min）離心，收集沉淀細胞。將細胞培養于胎牛血清培養液中，連續培養48 h后，測定TNF-α活性。

1.2.4 TNF-α活性的測定 根據Giffords的方法，在培養板上加入小鼠的TNF-α作陽性對照，確定小鼠TNF-α活性單位數（U/ml），并作標準曲線。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件對所有數據進行分析，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，計數資料采用 χ2檢驗，兩組間的相互比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

脂磷壁酸組小鼠的 TNF-α 為（78.45±34.21）U/ml；而對照組小鼠的 TNF-α 為（34.54±13.45）U/ml。 兩組間比較，差異有統計學意義（t=2.18＞1.86，P＜0.05）。

3 討論

TNF-α主要由巨噬細胞產生[5]，脂多糖能刺激巨噬細胞產生TNF-α。TNF-α有許多生物學活性，能抑制和殺死腫瘤細胞。在機體內外TNF-α均能殺死許多腫瘤細胞，也能抑制腫瘤細胞的增生。不同的腫瘤細胞對TNF-α的敏感性有很大的差異，甚至TNF-α能對某些腫瘤細胞有刺激增生作用。目前對TNF-α殺死腫瘤細胞的機制還不甚清楚，主要的觀點如下。①直接殺死腫瘤細胞：TNF-α與靶細胞受體結合后，進入到細胞內，與溶酶體結合，破壞溶酶體，使溶酶體穩定性降低，使各種酶外泄，導致細胞裂解。②調節機體的免疫功能：促進機體產生T淋巴細胞，從而殺傷腫瘤細胞。③作用于血管內皮細胞：使內皮細胞的血管功能紊亂，形成血栓，導致腫瘤組織血流供應阻斷，使之缺氧而死[6]。④使細胞增殖：T細胞NHCⅠ類抗原表達是依靠TNF-α來促進的，TNF-α能增強T細胞增殖能力，使T細胞分泌細胞因子，如CSF淋巴因子；TNF-α也能增強刺激B細胞的增殖，促使B細胞分泌Ig；對于某些腫瘤細胞，TNF-α具有生長因子樣作用[7]，與胰島素等一同促進細胞的增殖。⑤促進原癌基因表達：TNF-α也能促進原癌基因的表達（如c-Fos），這些原癌基因能促進細胞的增值，使細胞周期快速轉變。

只有TNF-α有活性才能行使生物學功能，目前研究比較多的是脂磷壁酸激活巨噬細胞產生TNF-α。有研究發現，將脂磷壁酸注射到腫瘤小鼠的腹腔內，能抑制小鼠體內癌細胞的生長，延長小鼠的生命，而未注射脂磷壁酸的腫瘤小鼠死亡較快。對小鼠血清進行測定發現，注射過脂磷壁酸的腫瘤小鼠TNF-α含量較未注射脂磷壁酸者要高，提示脂磷壁酸可能激活了巨噬細胞，促使其分泌大量的TNF-α來抵抗腫瘤細胞的生長[8]。目前對脂磷壁酸激活巨噬細胞產生TNF-α的機制解釋如下：巨噬細胞表面可能有脂磷壁酸的受體，脂磷壁酸能識別這些受體，吸附在巨噬細胞上，導致細胞表面第二信號的傳遞，第二信號受體（如PKA蛋白）進入細胞核激活TNF-α基因轉錄蛋白，從而使TNF-α基因開始轉錄和翻譯，產生TNF-α。TNF-α再進行細胞內運輸，分泌到巨噬細胞外，行使抗腫瘤作用。

通過本研究，證明了雙歧桿菌的脂磷壁酸確實能激活巨噬細胞產生TNF-α，從而為臨床治療提供了依據。

[1]陳檢芳，劉素軍，程冠生.肺癌、結核性胸膜炎和肺炎病人血清與胸水中 TNF-α 含量測定[J].湖南醫科大學學報，1996，21（4）：330-332.

[2]黃謙，宗文久，季明春.肺癌患者血漿腫瘤壞死因子水平及臨床意義[J].江蘇醫藥，1996，22（6）：171-172.

[3]王梅鳳，何浩明.血清、胸水TNF比值測定在良惡性胸水中的診斷價值[J].放射免疫學雜志，1998，7（1）：50-51.

[4]王立生，潘令嘉，施理，等.雙歧桿菌的完整肽聚糖對實驗性大腸癌的抑制作用及誘導其凋亡[J].中華消化雜志，1999，19（12）：331-334.

[5]王立生，潘令嘉，施理，等.雙歧桿菌對裸鼠腹腔巨噬細胞產生細胞因子以及細胞毒活性的影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2000，16（8）：35-37.

[6]陸正武，林志彬.嗎啡啡對小鼠巨噬細胞吞噬、細胞毒作用及誘生細胞因子的影響[J].基礎醫學與臨床，1994，14（3）：351-354.

[7]李勝棉，姚樹坤，馮麗，等.不同肝病變組織中CD34、CD31、Ki-67的表達及意義[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2004，13（1）：69-75.

[8]張陽德，張洋，潘一峰.磁性納米顆粒靶向性腫瘤熱療的研究進展[J].中國醫學工程，2006，14（2）：148-152.