乙型肝炎病毒檢測罕見模式1例

靳克儉

·臨床案例·

乙型肝炎病毒檢測罕見模式1例

靳克儉

采用ELISA及化學(xué)發(fā)光法檢測乙型肝炎病毒五種血清標(biāo)志物, 在本肝病專科實(shí)驗(yàn)室檢測過程中, 發(fā)現(xiàn)一例未經(jīng)報(bào)道的罕見病例模式(－＋＋－＋), 其檢測結(jié)果具有明顯特殊性, 本文就此病例進(jìn)行探討, 試圖討論其機(jī)制機(jī)理, 以期引起相關(guān)專業(yè)工作者的注意, 提高檢測準(zhǔn)確性, 并為病毒基因復(fù)制的深入研究提供參考。

乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物模式是目前肝炎病毒診斷和臨床分析的重要依據(jù), 隨著乙型肝炎病毒治療水平的不斷提高,治療和用藥的不同, 隨著病毒的變異, 也使HBV血清學(xué)模式呈現(xiàn)了多樣性, 使臨床醫(yī)生對HBV血清標(biāo)志物報(bào)告的分析和解釋越來越難, 從而影響診療。近期蘭州市第二人民醫(yī)院肝病專科實(shí)驗(yàn)室又發(fā)現(xiàn)一例為HBsAg陰性、HBsAb陽性、HBeAg陽性、HBeAb陰性、HBcAb陽性的罕見模式。與常見模式及所報(bào)道罕見模式［1］不同。

1 儀器及試劑

1.1 儀器 美國ABI7300PCR擴(kuò)增儀、采用美國ABI3130測序儀、科華ST-360酶標(biāo)儀。

1.2 試劑 HBV ELISA定性檢測用英科新創(chuàng)(夏門)科技有限公司試劑盒、HBV化學(xué)發(fā)光定量檢測用上海科華生物工程有限公司試劑盒、HBV核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測乙肝病毒DNA用上海科華生物工程有限公司試劑盒、S區(qū)測序提取用星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司的HBV乙肝核酸定量檢測試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 血清學(xué)檢測采用ELISA法及化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb五種血清學(xué)標(biāo)志物。

1.3.2 HBV DNA定量檢測采用HBV核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測乙肝病毒DNA。

1.3.3 基因測序采用PCR結(jié)合DNA測序?qū)BV S區(qū)基因

進(jìn)行多態(tài)性檢測,并應(yīng)用Chromas軟件進(jìn)行比對和分析

2 結(jié)果

2.1 ELISA不同時間段檢測同一患者三次采血樣本結(jié)果均為HBsAg陰性、HBsAb陽性、HBeAg陽性、HBeAb陰性、HBcAb陽性。化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果HBsAg <0.01 (ng/ml)、HBsAb 147(mIU/ml)、HBeAg 2.24 ( ncu/ml)、HBeAb<0.01(ncu/ ml)、HBcAb13.2 (ncu/ml)。

2.2 HBV DNA檢測結(jié)果2.89×106 copies/ml,為中度復(fù)制。

2.3 S1區(qū)變異位點(diǎn):2526T/A,2530A/C,2557A/G,2563G/A, 2572A/ C, 2620G/A,2636T/A, 2680G/A,2677C/A,2683C/T,2700G/ T,2713T/C,2716G/A,2766C/T,2793A/C,2876A/G,2896T/ A,2942C/T,2946G/A,2950G/A,2999A/C,3000C/A.

S2區(qū)變異位點(diǎn):160G/A,195T/C,196G/A,293C/A,356C/T, 585A/ G,747C/A,723T/C,734C/T, 833G/A,839T/C,885A/G,954T/C.

3 結(jié)論

前S1區(qū)突變主要發(fā)生在后半段；前S2區(qū)nt585突變, 導(dǎo)致HBsAg第145 位甘氨酸被精氨酸取代,顯著降低了HBsAg的抗原性, 使之不能與單克隆抗“A”抗體及疫苗接種后抗體或恢復(fù)期血清抗體結(jié)合或者結(jié)合力下降, 從而產(chǎn)生免疫逃避株而感染患者。

4 討論

HBV基因組全長約3200 bp, 是部分雙鏈的環(huán)狀DNA, 其負(fù)鏈核苷酸序列有4個相互重疊的開放讀碼框(ORF), 分別為S、C、P和X區(qū)。HBV自身編碼的DNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶功能, 可由前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄合成子代病毒基因組, 但逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏3'-5'的校對功能, 造成子代HBV基因組與模板之間存在一定的差異, 在復(fù)制過程中極易產(chǎn)生突變, 理論上來說,一個乙肝感染患者可以每天出現(xiàn)多達(dá)1010-11次突變(10-5RT突變率/bp/病毒/d×3200bpHBV基因組×1012-13病毒/d［2,3］)。HBsAg由S區(qū)基因編碼, 其優(yōu)勢共同抗原表位“A”決定簇位于高度保守的124~147位氨基酸親水區(qū), 是HBV各血清亞型的共同決定簇, 在所有血清亞型中均存在。“A”決定簇借2對二硫鍵形成2個環(huán)狀結(jié)構(gòu),其獨(dú)特的空間構(gòu)象使其具有極強(qiáng)的抗原性, 機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)性抗體中90%以上針對“A”決定簇, 該部位氨基酸的替代造成的蛋白結(jié)構(gòu)改變是HBsAg抗原性漂移產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)。抗原分子的立體結(jié)構(gòu)是決定抗原與淋巴細(xì)胞抗原受體結(jié)合引起免疫應(yīng)答的關(guān)鍵, 也是決定抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)各種免疫反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。若抗原立體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 可使抗原性改變或喪失HBsAg蛋白結(jié)構(gòu)中發(fā)生氨基酸替代后,一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 導(dǎo)致維持和穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)的各種氨基酸側(cè)鏈之間的作用平衡被打破,而形成新的平衡和空間構(gòu)象。HBsAg突變主要出現(xiàn)在乙肝病毒S蛋白的“A”決定簇(124 -148a·a)。“A”決定簇有兩個通過二硫化鍵相連的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在“A”決定簇中, HBsAg主要的突變出現(xiàn)在141-145a·a間,其中g(shù)ly-145-arg報(bào)道的最多［4-7］。

本文中病例的a突變與上述報(bào)道相符。由于氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的不同,甘胺酸(glycine)到精氨酸(arginine)的突變改變了“A”決定簇中腔結(jié)構(gòu)的空間,而這一部位是抗原和抗體結(jié)合的十分重要的位點(diǎn)。由于HBV的診斷和篩查試劑都是基于抗原和抗體結(jié)合的機(jī)制,而突變株會影響抗原和抗體間的結(jié)合,并最終影響到試劑的性能。

因條件有限, 本文未對該病例運(yùn)用更多的檢測手段(如雅培珠法)進(jìn)行更深入的檢測, 這是本文的不足之處。在今后的工作中我們應(yīng)對HBsAg突變的具體機(jī)制進(jìn)行更深入的探究, 為臨床對乙型肝炎相關(guān)疾病進(jìn)行準(zhǔn)確和及時的診治提供有價值的信息。

［1］ 呂迎霞, 張學(xué)東, 于林.乙肝五項(xiàng)定量檢測及罕見模式分析.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2012,9(14):1820-1821.

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Using ELISA and chemiluminensense to detecting HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb, during the testing of these five biomarkers in serum.We have discovered a rare pattern, his detecting results(-＋＋－＋)are uncommon and never reported before; we are discussing this pattern in the article, trying to drawing other researchers attention and make it out.Also hope to enhance the accuracy of detection.

HBV; Uncommon pattern; Gene reproduction

730046 蘭州市第二人民醫(yī)院肝病研究所

【關(guān)鍵詞】乙肝；罕見模型；基因復(fù)制

A rare pattern in hepatitis b virus detecting JIN Ke-jian.The NO.2 People's Hospital of Lanzhou 730046,China