人泛素－核糖體蛋白27a原核表達載體構建及表達＊

曾 濤，何 德（廣東醫學院醫學檢驗學院，廣東東莞 523808）

泛素－核糖體蛋白S27a（UBRPS27a）是泛素和核糖體蛋白的融合蛋白，由RPS27A基因編碼[1]。核糖體蛋白S27a（RPS27a）為核糖體40S亞基組成蛋白之一，除參與蛋白質合成外，還具有其他重要功能。RPS27A基因在多種活性增殖細胞中高度表達，其過表達是肝癌、胃癌、結腸癌等多種惡性腫瘤的典型特征，很可能是惡性轉化細胞或腫瘤組織的標志物，但其在腫瘤細胞中的功能作用及其分子機制尚未清楚[2－5]。本研究以原核系統表達人UBRPS27a，旨在為進一步研究其結構與功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 原核表達載體pGEX4T－1、人急性早幼粒細胞白血病HL－60細胞株、大腸埃希菌JM109及BL21（DE3）由廣東醫學院生物化學與分子生物學研究所保存。Taq DNA聚合酶、限性內切酶BamHⅠ和SmaⅠ、DNA T4連接酶、DL2000 DNA分子標記物、λHindⅢ標記物、載體PMD18－T購自TaKaRa公司。質粒抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自TIANGEN公司。TRIzol試劑和反轉錄（RT）聚合酶鏈反應（PCR，RT－PCR）試劑盒購自Invitrogen公司。其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 RPS27A基因cDNA全長克隆 根據人RPS27A基因cDNA序列（GenBank NM＿002954）以及pGEX4T－1載體上的多克隆位點設計上游引物P1（5′－CGC GGA TCC ATG CAG ATT TTC GTG AA－3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點）及下游引物P2（5′－TCC CCC GGG TTA CTT GTC TTC TGG TTT G－3′，下劃線部分為SmaⅠ酶切位點），由上海生工公司合成。收集對數生長期HL－60細胞，TRIzol試劑抽提總RNA，Oligo dT18引物反轉錄合成RPS27AcDNA第1鏈；以P1和P2為引物，RT－PCR擴增RPS27A編碼區cDNA片段全長，擴增反應條件為95℃5min，94℃45s、52℃1min、72℃1min循環35次，72℃10min，取擴增產物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外分析儀上觀察擴增結果并拍照；將膠回收法純化的目的片段與PMD18－T載體進行T／A克隆重組，挑選單克隆菌落，PCR鑒定陽性克隆送上海生工公司測序；用質粒提取試劑盒抽提經測序驗證克隆正確的質粒DNA（TRPS27A）。

1.2.2 pGEX4T－1－RPS27A重組質粒構建 以BamHⅠ和SmaⅠ對T－RPS27A質粒和pGEX4T－1載體進行雙酶切，酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳分離；膠回收法純化的目的基因DNA片段與線性載體DNA片段在T4連接酶作用下連接過夜，轉化感受態JM109細菌；挑取單克隆菌落接種于含氨芐西林（Amp＋）LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，提取質粒DNA，PCR與雙酶切法鑒定后將陽性候選克隆送上海生工公司測序。

1.2.3 重組質粒誘導表達 以測序驗證正確的pGEX4T1－RPS27A重組質粒轉化感受態BL21細菌，挑選單克隆菌落，PCR與雙酶切法鑒定；將含重組質粒的BL21細菌接種于Amp＋LB培養基，振蕩培養過夜；將過夜培養菌按體積比1∶30接種于新鮮LB培養基，37℃劇烈振蕩培養至A600約為0.5，加1mmol／L異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）培養4h；以冰預冷磷酸鹽緩沖液懸浮菌體，超聲破碎，離心取上清進行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），考馬斯亮藍R250染色后觀察結果。

2 結 果

2.1 RPS27A基因cDNA全長克隆 RT－PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，在200bp與500bp之間發現1條清晰DNA條帶，大小與目的基因預期片段480bp相符（見圖1）。

圖1 RPS27AcDNA擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 pGEX4T1－RPS27A重組質粒酶切鑒定 PCR鑒定陽性重組質粒雙酶切產物瓊脂糖凝膠電泳顯示，酶切獲得的2個片段分別與pGEX4T－1載體（4 950bp）及RPS27A目的片段（480bp）預期大小相符（見圖2）。測序結果顯示重組質粒中插入DNA片段序列與RPS27A基因cDNA全長完全一致（見圖3）。

圖2 pGEX4T－1－RPS27A重組質粒酶切鑒定

2.3 GST－UBRPS27a融合蛋白誘導表達 pGEX4T－1－RPS27A重組質粒誘導表達產物電泳圖出現了2個過表達蛋白條帶，1條與GST－UBRPS27a融合蛋白相對分子質量（RMM）44×103（GST、UBRPS27a的RMM分別為26×103和18×103）相符，表達效率很高，另出現1條RMM稍小的蛋白條帶（見圖4）。

圖3 pGEX4T1－RPS27A重組質粒中插入DNA片段部分測序圖譜

圖4 SDS－PAGE分析大腸桿菌GST－UBRPS27a重組蛋白的表達

3 討 論

人UBRPS27a蛋白N端是泛素，C端是RPS27a，兩端結構域在不同物種中均高度保守。RPS27a通過C4型鋅指結構域與DNA結合，組成核糖體結構，參與蛋白合成。RPS27a通常與泛素融合，主要存在于細胞質中。泛素在核糖體合成過程中作為分子伴侶，在RPS27a進入核糖體之前對其有保護和穩定作用。本研究擴增了RPS27A基因編碼區全長cDNA，成功構建了pGEX4T－1－RPS27A重組質粒，并在大腸埃希菌中誘導表達了GST－UBRPS27a融合蛋白，為進一步利用GST標簽進行UBRPS27a蛋白純化、制備其單克隆抗體及研究其結構奠定了基礎。蛋白誘導表達產物電泳圖顯示除GST－UBRPS27a融合蛋白高效表達外，另有1條RMM相對較小的條帶（約30×103左右）過表達。為排除其他混雜克隆的干擾，本研究將pGEX4T－1－RPS27A重組克隆在Amp＋LB培養基上進行劃線培養，挑取單克隆菌落重新誘導表達后，依然出現該條帶。由此可見該蛋白條帶是特異的，考慮可能為GST－UBRPS27a融合蛋白部分降解產物，有待后續實驗進一步驗證。

RPS27A基因的表達在多種腫瘤組織中異常升高，可能在腫瘤發生、發展中具有重要作用。該基因是一種早期生長反應基因，在結腸癌及胃癌組織中的表達明顯高于周邊正常黏膜組織[4]。而且RPS27A基因在低分化肝癌中的表達較正常水平升高20倍以上，用RNA干擾方法沉默RPS27A基因可導致腫瘤細胞周期停滯及細胞萎縮，說明該基因與肝癌發生有關[6]。RPS27A基因在胰腺癌的癌前病變組織表達水平升高，可用于胰腺癌早期鑒別診斷。深入分析RPS27A基因與腫瘤的關系有利于發現新的腫瘤標志物及臨床治療靶標。但目前對該分子在腫瘤細胞中的具體功能及分子作用機制所知尚少。蛋白激酶CK2與多種腫瘤密切相關，是目前腫瘤治療研究中的靶點之一[7]。黃功華等[8]采用酵母雙雜交技術篩選HL－60細胞cDNA文庫時發現，人UBRPS27a是CK2α′亞基的候選結合蛋白。但酵母雙雜交系統有可能存在假陽性結果。故本研究誘導表達的GST－UBRPS27a融合蛋白為采用GST pull down試驗驗證UBRPS27a與CK2α′亞基的相互作用準備了條件，也為后續研究UBRPS27a結構與功能及其在腫瘤發生發展過程的分子調控機制奠定了基礎。

[1]Kirschner LS，Stratakis CA.Structure of the human ubiquitin fusion gene Uba80（RPS27a）and one of its pseudogenes[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，270（3）：1106－1110.

[2]Ganger DR，Hamilton PD，Klos DJ，et al.Differential expression of metallopanstimulin／S27ribosomal protein in hepatic regeneration and neoplasia[J].Cancer Detect Prev，2001，25（3）：231－236.

[3]Mafune K，Wong JM，Staniunas RJ，et al.Ubiquitin hybrid protein gene expression during human colon cancer progression[J].Arch Surg，1991，126（4）：462－466.

[4]Wong JM，Mafune K，Yow H，et al.Ubiquitin－ribosomal protein S27agene overexpressed in human colorectal carcinoma is an early growth response gene[J].Cancer Res，1993，53（8）：1916－1920.

[5]Revenkova E，Masson J，Koncz C，et al.Involvement of Arabidopsis thaliana ribosomal protein S27in mRNA degradation triggered by genotoxic stress[J].EMBO J，1999，18（2）：490－499.

[6]Fatima G，Mathan G，Kumar V.The HBx protein of hepatitis B virus regulates the expression，intracellular distribution and functions of ribosomal protein S27a[J].J Gen Virol，2012，93（4）：706－715.

[7]Trembley JH，Chen Z，Unger G，et al.Emergence of protein kinase CK2as a key target in cancer therapy[J].Biofactors，2010，36（3）：187－195.

[8]黃功華，梁景耀，陳碧，等.用酵母雙雜交系統篩選泛素／核糖體蛋白S27a[J].癌癥，2005，24（1）：40－46.