紫外分光光度法測定復方氫醌脂質體含量和包封率＊

劉 娟，廖 娟，李 遠，金 梅（重慶醫科大學附屬永川醫院，重慶 402160）

復方氫醌制劑結合了氫醌能降低皮膚色素沉著和維甲酸能消除皮膚細小的皺紋的特點，主要用于治療黃褐斑、雀斑及炎癥后色素沉著斑等[1]。然而，氫醌作為光感性物質，性質極不穩定，易氧化變色而失效，維甲酸則刺激性比較大[2－3]。筆者制備了復方氫醌脂質體，旨在對提高氫醌抗氧化能力和降低維甲酸的刺激性，但目前國內外尚無可用于復方氫醌脂質體體外分析的方法[4－6]。本研究擬建立其體外藥物分析方法，為進一步分析其體外藥物釋放行為奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 CP224電子天平（上海奧豪斯），RE－52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮），SHB－Ш循環水式多用真空泵（上海瑞智），Varioskan Flash酶標儀（美國Thermo），Purelab classic純水器（法國Elga），SB－5200DTDN超聲波清洗機（寧波新芝），Neofuge 15R離心機（香港力康），GL－88B旋渦混合器（海門其林貝爾）。復方氫醌脂質體（氫醌1 200μg／mL，維甲酸200 μg／mL）和空白脂質體由本院中心實驗室自制。氫醌（成都科龍）、維甲酸（上海安耐吉）、硫酸氫鈉（天津大茂）、無水乙醇（美國Amresco）、Ⅱ－S型磷脂（美國Sigma）、膽固醇（純度大于98%，上海生工生物）均為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 空白脂質體和復方氫醌脂質體的制備 聯合采用薄膜分散法和超聲法制備空白脂質體和復方氫醌脂質體。具體操作如下：稱取處方量磷脂和膽固醇置于茄形瓶中，加入適量氯仿，待膜材溶解完全后，快速加入氫醌、維甲酸和硫酸氫鈉的無水乙醇溶液后混勻，50℃水浴減壓旋轉蒸發，去除有機溶劑，制備均勻干膜；加入50℃預熱的0.2mol／L磷酸緩沖液（pH5.7）50mL，旋轉洗膜，超聲30min，制備復方氫醌脂質體懸液，4℃放置備用?？瞻字|體制備方法同上，加入的無水乙醇溶液不含氫醌和維甲酸。

1.2.2 方法專屬性 按處方量稱取維甲酸、氫醌和空白脂質體，無水乙醇完全溶解，分別進行紫外掃描。

1.2.3 線性范圍 按處方量稱取維甲酸和氫醌，無水乙醇完全溶解，制備200μg／mL維甲酸和1 200μg／mL氫醌混合溶液，分別用無水乙醇稀釋40、20、10、8、5倍，每一濃度為3個樣本，檢測波長294、340nm處吸收峰，并對氫醌和維甲酸濃度作圖，得到標準曲線。

1.2.4 精密度實驗 取上述40、20、10倍稀釋的維甲酸和氫醌混合溶液，以高、中、低3個濃度水平的混合樣品進行檢測。每一濃度制備5個樣品，1d內連續測定5次計算日內精密度；每日測定1次，連續測定5d，計算日間精密度。將日內精密度代入回歸方程，計算測得量，以測得量與加入量之比計算相對回收率。

1.2.5 回收率實驗 分別在空白脂質體中加入維甲酸，使其濃度分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50mg／mL，并按處方比例加入氫醌，空白脂質體定容至1mL，振蕩混勻。取200μL破乳，稀釋后分別在294、340nm處測定絕對回收率。

1.2.6 氫醌與維甲酸濃度檢測 吸取復方氫醌脂質體0.2 mL至試管中，0.8mL氯仿破乳，加入0.8mL無水乙醇稀釋，搖勻，取0.2mL稀釋5倍后作為供試液，分別測定294、340 nm處吸收峰。根據標準曲線計算氫醌和維甲酸濃度。

1.2.7 脂質體包封率 取1mL脂質體懸液，4℃條件下12 000r／min離心20min，取上清液0.2mL，破乳稀釋后測定包封率，包封率（%）＝（C總－C上清液）／C總×100%[7]。

2 結 果

2.1 方法專屬性 維甲酸和氫醌分別在波長340、294nm處有吸收；在294nm處，空白脂質體有一定吸收，對檢測專屬性有稍許影響，故檢測脂質體氫醌含量時，須扣除空白脂質體在294nm的吸收；維甲酸在294nm處吸收小，對氫醌的干擾較小。氫醌和空白脂質體在維甲酸檢測波長340nm處吸收較小，基本無干擾。見圖1。

2.2 線性范圍 維甲酸濃度5～40μg／mL，以340nm處光密度值（OD值）為縱坐標，以維甲酸濃度為橫坐標，得到直線回歸方程：Y＝0.016 4X＋0.054（r2＝0.99，n＝5）。氫醌濃度30～240μg／mL，以290nm處OD值為縱坐標，以濃度為橫坐標，得到直線回歸方程：Y＝0.117 9X＋0.158 1（r2＝0.99，n＝5）。

2.3 精密度和回收率 維甲酸、氫醌絕對回收率分別為96.6%[n＝5，相對標準偏差（RSD）4.7%]和93.3%（n＝5，RSD4.9%）；相對回收率均值為80.95%。見表1。

圖1 維甲酸、氫醌及空白脂質體紫外掃描圖

表1 日內精密度、日間精密度及方法回收率（n＝5）

2.4 脂質體濃度與包封率 根據標準曲線計算氫醌和維甲酸的濃度分別為91.7%（RSD0.022）、90.0%（RSD0.019）。制備2個批次脂質體，氫醌包封率分別48.2%、48.9%，維甲酸包封率為77.1%、78.4%。

3 討 論

氫醌是顏面皮膚色素沉著病局部用藥的首選藥物，由于為對苯二酚結構，性質極不穩定，易氧化變色而失效，在光照及堿性條件下尤甚，故本實驗選無水乙醇作溶媒，棕色容量瓶做容器，以減少誤差。由于無水乙醇易揮發，所以在測定紫外吸收時，比色皿均加蓋，以減少由于溶媒揮發而造成誤差。

本研究制備的復方氫醌脂質體結合了氫醌能降低皮膚色素沉著和維甲酸能消除皮膚細小皺紋的優勢。利用脂質體作為藥物載體，可增加藥物溶出度，增強藥物進入角質層或表皮類脂內的作用，增加藥物在皮膚局部的積累，緩慢持續釋放藥物，有利于保持局部藥物濃度[8－9]。

復方氫醌脂質體中的氫醌、維甲酸在紫外區都有吸收，故本研究將氫醌、維甲酸與空白脂質體單獨掃描，結果顯示按處方量用無水乙醇溶解的維甲酸和氫醌檢測波長分別為294、340nm。在294nm的氫醌檢測波長處，維甲酸吸收較小，對氫醌的干擾較小，但空白脂質體在該波長下有一定吸收，故在實際檢測中，本研究用空白脂質體作對照，以扣除空白脂質體對氫醌檢測的影響，平均回收率為86.76%。氫醌和空白脂質體在340nm的維甲酸檢測波長處吸收較小，基本無干擾，因此維甲酸仍在340nm波長處檢測。用紫外分光光度法測定復方氫醌脂質體濃度和包封率結果準確可靠，簡單易行，可推廣。

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