宮頸脫落細(xì)胞RASSF1A基因甲基化在宮頸癌中的臨床意義

李 琦，胡昌華，張 婧（.武漢市漢陽醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢 430050；2.襄陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北襄陽 4402）

RAS相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）可增強(qiáng)絲氨酸－蘇氨酸激酶MstI活化，抑制Cyclin D1積聚而促進(jìn)細(xì)胞死亡受體信號(hào)傳導(dǎo)通路，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[1－2]。RASSF1A基因在宮頸癌組織中呈高甲基化狀態(tài)，可作為宮頸癌分子診斷和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物[3－4]，但僅可用于術(shù)后組織標(biāo)本檢測，臨床應(yīng)用受限。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）檢測宮頸癌患者和健康女性宮頸脫落細(xì)胞RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，研究宮頸脫落細(xì)胞RASSF1A基因甲基化在宮頸癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年1月至2012年6月經(jīng)手術(shù)治療的75例初治宮頸癌患者，年齡35～80歲，平均50.5歲，包括鱗狀細(xì)胞癌56例、腺癌12例、腺鱗癌7例，根據(jù)2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（Figo）宮頸癌分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ期15例、Ⅱ期35例、Ⅲ期17例、Ⅳ期8例。同期體健健康女性75例納入對(duì)照組，年齡34～80歲，平均50.4歲。年齡分布組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法 由臨床醫(yī)生采集宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，以DNA提取試劑盒（北京天根）提取細(xì)胞DNA，經(jīng)甲基化修飾試劑盒（北京天漠）處理后，進(jìn)行MSP檢測。采用Methyl Primer Express V1.0設(shè)計(jì)MSP引物，引序列見表1，由大連寶生物工程有限公司合成。MSP反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件為95℃10min，95℃1min、65℃30s、72℃30s循環(huán)35次，72℃10min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

表1 RASSF1A基因MSP引物序列（5′→3′）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法；顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化檢測結(jié)果 宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率為64.0%（48／75），健康女性為甲基化率為1.3%（1／75），宮頸癌患者甲基化率高于健康女性（P＜0.05）。

2.2 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化與病理因素的關(guān)系 不同年齡和病理類型宮頸癌患者RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但不同組織學(xué)分級(jí)、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、器官轉(zhuǎn)移、Figo分期患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化與病理因素的關(guān)系

3 討 論

RASSF1A基因位于3號(hào)染色體短臂中的抑癌基因，可抑制Cyclin D1積聚而促進(jìn)細(xì)胞死亡受體信號(hào)傳導(dǎo)通路，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[5]。RASSF1A基因在結(jié)腸癌、胃癌等消化系統(tǒng)腫瘤中呈高甲基化狀態(tài)，甲基化導(dǎo)致基因發(fā)生表觀遺傳學(xué)改變，通過阻遏轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合，抑制或下調(diào)RASSF1A表達(dá)水平，使其失去對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變[6－8]。崔華英等[3]研究結(jié)果表明，宮頸癌組織RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率高達(dá)73.8%，認(rèn)為RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化可作為宮頸癌的分子診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。本研究中，宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率為64.0%，高于健康女性，與宮頸癌組織檢測結(jié)果相比，甲基化率稍低，但宮頸脫落細(xì)胞檢測可在術(shù)前進(jìn)行，使其具有更好的預(yù)測性。

甲基化是表觀遺傳學(xué)最重要的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控機(jī)制，可引起染色體及DNA空間構(gòu)象發(fā)生改變，主動(dòng)或被動(dòng)阻遏轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)而調(diào)控基因表達(dá)[9]?；騿?dòng)子甲基化與腫瘤發(fā)生、病情進(jìn)展及預(yù)后緊密相關(guān)，可作為腫瘤的基因水平生物學(xué)標(biāo)志物，比蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物具有更高的靈敏度及特異性[10]。本研究中，宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率在不同年齡和病理類型患者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但在不同組織學(xué)分級(jí)、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、器官轉(zhuǎn)移、Figo分期患者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），組織學(xué)分級(jí)高、腫瘤最大徑大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及器官轉(zhuǎn)移、Figo分期晚的患者宮頸脫落細(xì)胞RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率高于組織學(xué)分級(jí)低、腫瘤最大徑小、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及器官轉(zhuǎn)移、Figo分期早的患者，說明與宮頸癌組織類似，宮頸脫落細(xì)胞RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌患者病情及預(yù)后密切相關(guān)，可作為分子診斷及病情預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。

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