瞬時受體電位C通道研究進展

殷 欣，孫軼華

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院檢驗科，黑龍江哈爾濱150081)

鈣離子(Ca2+)是細胞信號傳導過程中重要的第二信使，在細胞內傳遞信息并調控一系列生命過程。當細胞受到相應刺激時，細胞會通過各種途徑升高細胞內Ca2+濃度，胞漿內Ca2+濃度的升高主要來源于2個方面:外鈣內流和細胞內鈣庫釋放。外鈣內流的途徑主要分成3大類:電壓門控的鈣通道(voltage depentent calcium chnnel，VOC)、受體門控的鈣通道(receptor operated calcium chnnel，ROC)和庫操縱性鈣通道(storeoperated calcium channels，SOC)。VOC 和 ROC 的特性是在短時間內產生大量的鈣內流，SOC則產生較小的、持續的鈣內流。細胞膜上持續的鈣內流保證了信號的正常傳播。目前認為，瞬時受體電位C(TRPC)通道家族成員是構成細胞膜上SOC和ROC的分子基礎。

一、TRP通道

瞬時受體電位通道(TRP)基因首次發現于黑腹果蠅的視覺傳導系統中，突變體果蠅對持續的光刺激只產生瞬時而非持續的鋒電位，因而得名。迄今已在果蠅、蠕蟲以及哺乳動物等生物體先后發現了多種TRP通道。依據氨基酸序列的同源性，將TRP通道分為7個亞族［1］，分別為 TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML、TRPN。TRP通道與電壓依賴性陽離子通道類似，具有6次跨膜(S1-S6)結構域，以及位于胞內的N末端和C末端。TRP通道的S5與S6之間的片段內嵌構成離子通過孔道，因S4片段缺乏通常電壓依賴性陽離子通道S4片段所具有的正電荷氨基酸殘基，所以TRP通道屬于非電壓依賴性的離子通道，主要通過的離子為Ca2+與鈉離子(Na+)，幾乎所有的功能性TRP通道都對Ca2+具有通透性。

TRP作為細胞重要的感受器，傳遞細胞內、外的信息，對來自細胞內、外環境的物理和化學等多種刺激信號產生反應，以維持細胞的生存和參與細胞的眾多基本生理活動，同時也受來自細胞內、外的信使分子、化合物以及溫度、滲透壓等變化的調節。TRP參與的功能主要包括溫度和疼痛感覺(TRPVI、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8 和TRPAI亞家族)、機械感覺(TRPV2、TRPV4、TRPM3、TRPA1、TRPP1、TRPP2、TRPML3 和 TRPC1 亞家族)、味覺(TRPM5、TRPP2亞家族)、維持細胞離子穩態(TRPV5、TRPV6、TRPM6和 TRPM7亞家族)、參與細胞生長調控(TRPM亞家族)以及介導磷脂酶C(PLC)依賴的鈣內流(TRPC亞家族)。

二、TRPC通道

1.TRPC通道的結構和分型 TRPC即傳統型TRP通道，該亞家族與果蠅的TRP通道同源性最高，故得名。TRPC是瞬時受體電位通道家族中最早發現的成員，具有TRP通道普遍的結構特征，屬于非電壓依賴性的離子通道。TRPC亞家族包括TRPC1～7共7個亞型，其中TRPC2在人類是偽基因，只表達于大鼠和小鼠。根據氨基酸序列同源性及功能相似性，TRPC通道分為4類:TRPC1、TRPC2、TRPC3/6/7和 TRPC4/5。大量研究結果提示，功能性TRPC通道是由相同或不同亞型組成的四聚體組成。TRPC四聚體孔道區具有高度保守性，該區域的定向誘變可導致通道活性喪失［2］。

2.TRPC通道的分布和功能 TRPC亞家族不同成員分布不同，通道激活后發揮的功能亦不同。TRPC1分布很廣，在腦、心臟、腎臟、肺、骨骼肌、前列腺、皮膚、睪丸和卵巢都存在高水平表達。作為最早被發現的哺乳動物TRP通道，TRPC1主要的功能為參與受體介導的、鈣依賴的分泌和收縮過程;TRPC2在人類是偽基因，在小鼠可能作為信息素感受體以及參與精子頂體反應;TRPC3主要分布于腦、胎盤、心臟、骨骼肌和平滑肌，參與腦源性神經生長因子(BDNF)介導的神經分化、血管收縮和抗原刺激引起的淋巴細胞免疫反應。曾有報道［3］TRPC3和另一種重要的鈣調節器，鈉鈣交換體(NCX)偶聯，Na+通過TRPC3通道進入細胞內，激活NCX的逆向轉運，從而使細胞內Ca2+濃度增加;TRPC4主要分布于腦、睪丸、胎盤、腎上腺和內皮細胞，參與血管收縮、微血管滲透以及外側膝狀體γ-氨基丁酸(GABA)能神經的輸入。TRPC4基因被敲除的小鼠呈現出主動脈內皮細胞的鈣內流消失，一氧化氮(NO)合成受損，以及血管舒張功能減退。在肺血管內皮細胞中，表現為鈣內流減弱，微血管通透性降低。TRPC5主要分布于腦、肺、睪丸和胎盤，可能與生長錐的形成和腦的發育有關。TRPC6分布于肺、心臟、腦和肌肉，可能參與血管收縮和血小板聚集。TRPC7主要分布于心臟、肺、眼、腦、脾臟和睪丸，現在對其參與的功能還尚未明確。

3.TRPC通道激活機制 TRPC通道的激活受多種因素的調節，包括滲透壓、pH值、機械力及一些內、外源性配體和細胞內信號分子。盡管目前TRPC通道的激活機制還存在某些爭議，但能被磷脂酶C(PLC)偶聯的膜受體激活已被證實。TRPC通道主要激活機制可歸納為以下:內、外源性配體和細胞內信號分子分別作用于G蛋白偶聯受體和受體酪氨酸激酶偶聯受體，激活PLC β和γ，PLC激活后水解4，5二磷酸磷脂肌醇(PIP2)，生成肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，細胞內IP3水平的升高使IP3敏感的鈣庫釋放Ca2+。當鈣庫耗竭，促使細胞膜 TRPC通道激活，繼而引發Ca2+流入細胞內填充鈣庫。此外，保留在細胞膜上的DAG也可直接激活TRPC通道。根據激活機制的不同，TRPC通道大致可分為兩類:(1)TRPC 1/4/5:具有SOC特性，在細胞內鈣池耗竭時被激活;(2)TRPC 3/6/7:表現出受體操縱性鈣通道特性，可由DAG及其代謝產物直接激活。另外，TRPC 3/6具有庫操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道雙重特性，在不同條件下表現出不同的特性［4］。

4.TRPC通道與鈣庫操縱性鈣通道 1986年，Putney［5］首先描述了一種依賴鈣庫耗竭激活Ca2+內流的現象:當細胞外刺激物活化細胞膜G蛋白耦聯受體或酪氨酸激酶受體后，細胞內PLC信號途徑被激活導致鈣庫釋放Ca2+，鈣庫耗竭;此時細胞膜上的鈣通道被激活并產生持續性Ca2+內流，并將其稱為庫容性鈣內流(capacitative calcium entry，CCE)，被激活的細胞膜鈣通道則被稱為SOC。這種Ca2+內流方式被稱為庫操縱性鈣內流(store-operated calcium entry，SOCE)。由上述受體蛋白信號轉導途徑所致的細胞內Ca2+呈雙相性升高，先是快速短暫升高，這是Ca2+從內質網中釋放所致;在達到峰值后又逐漸下降，并持續維持在較高的水平，形成平臺期，這是由SOCE所致。幾乎所有的TRPC亞型通道都可通過PLC信號途徑被激活。因此，可以認為TRPC通道此時起著SOC的作用。

5.TRPC通道參與細胞Ca2+的調節 相關研究表明［6］，TRPC1和 TRPC4參與或部分參與SOCE的形成。基因敲除模型的研究為 TRPC1參與SOCE提供了依據［7］。在 TRPC1/4陽性細胞系中，PLC介導或通過藥物(如毒胡蘿卜素)作用后引起細胞內鈣池中Ca2+外流，Ca2+損耗后可以增加SOCE;但通過SiRNA或藥物阻斷劑沉默、阻斷 TRPC1/4后，SOCE的形成明顯減少。另有研究顯示［8］，基因敲除內皮細胞的 TRPC1或 TRPC4后并不影響SOCE。來自TRPC4基因敲除小鼠模型的數據顯示:TRPC4-/-小鼠主動脈內皮細胞及新生小鼠肺血管內皮細胞中，SOCE較野生小鼠明顯減少，這表明TRPC4是SOC的重要組成部分。然而，TRPC4參與 SOCE也同樣受到質疑，有學者認為［9］，TRPC4的激活并不依賴鈣池的損耗而產生 SOCE，對于TRPC1/4與SOCE的關系或許由于細胞類型的不同而存在不同的該內流調節機制，因此，這些分歧還有待進一步的研究。人類細胞中TRPC2是含有6個突變位點的假基因，而在嚙齒動物中，關于TRPC2與SOCE的關系則有不同的觀點。有報道顯示非變異TRPC2在中國倉鼠卵巢及睪丸精原細胞中參與SOCE的形成［10］。TRPC3在腦組織中表達豐富，有觀點［11］認為TRPC3是由受體依賴PLC活化后的信號(如 DAG)直接激活，即 ROC;Kiselyov等［12］的觀點則與之相反，他們認為 TRPC3的活化開放依賴于鈣庫操縱，即SOC。而來自Vazqucz等［13］的研究發現，TRPC3參與SOCE或ROCE取決于其表達水平，在低表達水平時，TRPC3具有SOC的功能;反之則具有ROC的功能。TRPC5主要在中樞神經系統中表達，大多數證據表明TRPC5是由受體活化PLC-DAG傳導通路激活開放，并非由鈣池調節。但是在單個細胞水平的研究［14］中，TRPC5也會以鈣池操縱性鈣內流的方式參與調節細胞內Ca2+濃度，這可能與TRPC5表達水平對鈣池的敏感性有關。有研究［11］顯示，TRPC6是以受體偶聯PLC-DAG方式激活參與ROCE，并非 SOCE。但是在肺動脈高壓的研究中，肺動脈平滑肌(PASMCs)中TRPC6參與SOCE引起［Ca2+］增加，PASMCs收縮力增強。同時TRPC6引起的鈣內流也參與細胞除極，細胞內壓升高也會引起血管收縮作用。在肝癌細胞系(Huh-7、HepG-2)的研究［11］中發現肝癌細胞僅表達TRPC1和TRPC6，SOCE的增加與TRPC6呈正相關，而與TRPC1無相關性。在HEK293細胞的研究［11］發現，TRPC7的激活方式與蛋白表達水平相關，這一點與TRPC3相似。瞬時轉染實驗表明TRPC7激活方式依賴于受體偶聯PLC-DAG傳導通路;而當其表達水平穩定時則出現鈣庫操縱的激活方式。

6.TRPC通道與基質交感分子蛋白1(STIM1)、鈣釋放激活鈣調節蛋白1(CRACM1，即Orai1) 在STIM1和Orai1被發現之前，TRPC通道被認為是SOC的單一分子基礎。1992年，Hoth和Penner［15］用膜片鉗技術成功地將SOCE以電流的形式在肥大細胞(mast cell)上檢測到并將其命名為鈣釋放激活鈣離子通道(Ca2+release-activatedcd charmel，CRAC)。CRAC 是一種典型的SOC通道，其結構和激活與Orai1、STIM1密切相關。SOC主要是由TRPC蛋白形成的同源或異源四聚體與STIM1、Orai1共同組成。STIM1是一種存在于內質網上的鈣結合蛋白，可將內質網鈣離子負載信息傳遞給鈣庫操縱性鈣通道，對TRPC通道具有調控作用。STIM1由685個氨基酸構成，N端位于內質網內，含有1個EF-hand結構和1個SAM結構域。C端位于細胞質中，包括卷曲螺旋區，絲氨酸、脯氨酸富集區和賴氨酸富集區。EF-hand結構是 STIMl結合 Ca2+的部位，也是STIM1作為感受器的區域［16］，能感受內質網腔內Ca2+濃度下降;其他的結構域，如SAM結構域、C端的卷曲螺旋區、脯氨酸和賴氨酸富集區在STIM1顆粒的轉位及激活胞膜上的TRPC通道過程中起著重要的作用［16］。研究［17］表明，STIM1能調節除TRPC7外其余TRPC亞族的活性，從而影響SOC的功能。STIM1可直接調節TRPC1/4/5的功能，使其表現出SOC的作用，TRPC3/6與TRPC1/4結合組成TRPC通道異源四聚體后，可間接受STIM1調節，表現出SOC的功能。Orai1是一種位于細胞膜的高選擇性鈣離子通道蛋白，是構成CRAC通道的亞基。Orai1是在采用基因連鎖分析檢測嚴重聯合免疫缺陷(SCID)患者基因突變時首次被發現的。Orai1包括4個跨膜片段，其N端和C端都位于細胞內，第1個和第3個跨膜片段上存在Ca2+結合位點，所以具有Ca2+選擇性，其他離子很難從該通道進入細胞。Orai1與TRPC同樣位于細胞膜，共同形成CRAC的“門戶”，而位于內質網膜的STIM1分子是開啟這扇門的“鑰匙”［18］，STIM1和Orai1之間的相互作用對于CRAC通道的開啟和關閉有重要意義。研究［19］表明，Orai1可以同TRPC形成同源/異源復合體介導或者調節SOCE。除TRPC2外，TRPC家族其他成員間均可相互結合或與Orai蛋白結合組成SOC。當細胞內鈣庫中Ca2+減少到一定程度時，STIM1感受到此變化，聚合后向質膜移動，并與細胞膜上的TRPC通道、Orai1蛋白相互作用，引起胞外Ca2+內流，從而補充胞漿和鈣庫中的Ca2+，維持細胞的興奮性。

三、TRPC通道與疾病

作為鈣庫操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道的分子基礎，功能性TRPC通道可介導鈣庫控制的Ca2+內流，進而參與多種疾病的病理生理過程。有研究［20-21］發現，TRPC家族參與調控腫瘤的生長、侵襲、轉移過程，與某些中樞神經系統疾病的發生和發展相關［22］，且在原發性高血壓和心肌細胞凋亡中也有一定的作用［23］。據報道［24-25］，TRPC6 的功能異常可導致局灶性節段性腎小球硬化，并產生蛋白尿，最終進展至慢性腎功能衰竭;也可引起PASMCs增殖活性增強參與特發性肺動脈高壓(IPAH)的形成，并且與心肌肥大有關。

四、TRPC通道的檢測方法與研究前景

TRPC通道通過調控Ca2+內流影響機體的生理機能。在靜息生理狀態下，細胞內Ca2+濃度總是保持在極低的水平，其濃度的變化會影響機體的多種功能。因此，通過檢測TRPC蛋白的變化來協助診斷治療與此相關的疾病還是有一定意義的。更進一步的研究就是尋找TRPC的選擇性抑制劑，從而開發一類新型的鈣通道阻滯劑。目前電生理檢測和分子生物學基因敲除等仍然是研究TRPC蛋白最有效的方法，逆轉錄PCR與蛋白免疫印跡法也同樣廣泛運用在TRPC的檢測中。由于該領域的研究還剛展開不久，目前尚缺乏快速檢測TRPC蛋白變化的手段，此類方法雖然還有待發展，但已具有廣闊的應用價值。近年來Ca2+熒光探針的出現，可直接測定細胞內Ca2+的濃度［26］。

五、結語和展望

目前與TRPC通道相關的研究主要是圍繞基因缺陷性動物模型或抑制其在細胞中的表達來進行。大多數研究結果表明，抑制TRPC通道表達或使用阻滯劑可使細胞內Ca2+濃度降低，TRPC通道通過調控SOCE影響機體的生理機能。因此，TRPC通道阻滯劑有望成為一類新型的鈣通道阻滯劑。這為預防和治療相關疾病提供新的思路。隨著研究的深入，TRPC通道的更多功能也將會被人們逐漸認識。

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