不同浸提方式下HPLC測定蘋果渣中cAMP的研究

冉仁森，劉永峰，郭玉蓉，牛鵬飛

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062）

環腺苷酸（cyclic adenosine-3’，5’-monophosphate，cAMP）由三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）在腺苷活化酶催化下生成的生物活性物質[1]。cAMP普遍存在于動植物體內，可以激活依賴性蛋白激酶A磷酸化多種蛋白底物，調節cAMP反應元件結合蛋白活性，調控脂類的生物合成，促進脂肪酸β-氧化，調控基因轉錄，發揮其廣泛的生物學功能[2-3]。因此，研究動植物中提取cAMP，對于開發功能性食品具有重大的意義。上世紀70年代國外開始高等植物中cAMP的研究[4-5]，80年代后對于棗中的cAMP已開展了較多的研究[6-9]，發現棗成熟果肉中環核苷酸含量達10～300nmol/g。但是，對于蘋果及其果渣中cAMP的研究鮮有報道，僅有劉孟軍等[10]采用放射免疫法在研究14種園藝植物cAMP含量時，對蘋果鮮果進行了cAMP的測定。

眾所周知，我國是世界上第一大蘋果種植國和生產國，蘋果產量為3000多萬噸，其中大約有20%的蘋果用于生產加工成濃縮果汁、蘋果酒、果醬等產品，蘋果經生產加工后將產生大量的蘋果渣，約占蘋果總重量的25%，然而大量的蘋果渣除較少數用作飼料和燃料外，絕大部分被廢棄[11-13]。蘋果渣中的多種活性物質對于蘋果渣資源的開發利用具有積極的意義。因此，本文針對蘋果渣中的活性物質cAMP開展提取和檢測，首次利用水浸提與乙醇浸提兩種不同提取方式對蘋果渣中cAMP進行提取，并采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）對蘋果渣中cAMP的含量進行測定，以期為蘋果渣資源的綜合開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皇冠蘋果的肉渣 去皮，去籽，干燥、粉碎，過80目篩得到；cAMP標準品 規格：CAS號為60-92-4，純度≥99%，色譜純，德國Sigma公司；甲醇 規格：純度為99.8%，色譜純，加拿大Promptar公司；乙醇、磷酸二氫鉀 分析純。

高效液相色譜儀 美國Waters公司；色譜柱 美國Agilent公司；TU-2000型紫外可見分光光度計日本日立公司；旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品中cAMP的提取 設計兩種不同的浸提方法制備樣品溶液：利用蒸餾水浸提制備樣品溶液，按1∶20（g/m L）的料液比加入蒸餾水，混合均勻，于40℃水浴環境下提取24h，每隔8h攪拌一次，提取完成后，將提取液于（50±5）℃、0.096MPa的條件下真空濃縮并定容至50m L，冷卻至室溫后放入冰箱保存；利用乙醇浸提制備樣品溶液，按1∶20（g/m L）的料液比加入20%乙醇溶液，于40℃水浴環境下提取24h，每隔8h攪拌一次，提取完成后，將提取液于（50±5）℃、0.096MPa的條件下真空濃縮并定容至50m L，冷卻至室溫后放入冰箱保存。

1.2.2 標準品溶液的制備 精密稱取cAMP標準品0.0143g，用雙蒸水溶解并用容量瓶定容至250m L，搖勻得57.2μg/m L的儲備液，放入冰箱保存備用，保存時間為1d。

1.2.3 色譜條件的選擇

1.2.3.1 流動相的選擇 參考張倩等[14]的方法，進行流動相的選擇。本研究色譜柱為Agilent HCC18，5μm，4.6mm×250mm，流動相采用甲醇-含0.05moL/L磷酸二氫鉀的雙蒸水（體積比10∶90），流速1.0m L/m in，檢測室溫度為室溫，進樣量為20μL。

1.2.3.2 檢測波長的選擇 取上述cAMP標準品溶液，稀釋1倍，對其進行紫外全波長掃描，根據最大吸收率，確定其檢測波長。

1.2.4 cAMP的定性檢測 本研究采用保留時間法[15]，在相同的色譜條件下，以待測物質的保留時間與標準品保留時間相比對，相同的物質應具有一致的保留時間，進行所要分析組分的定性。

1.2.5 cAMP的定量檢測

1.2.5.1 標準曲線繪制 分別精密吸取體積為：5、15、25、35、45m L的標準品溶液于50m L容量瓶中，加流動相定容至刻度搖勻，分別獲得濃度為5.72、17.16、28.60、40.04、51.48μg/m L的系列標準溶液，過0.45μm濾膜。分別精密吸取系列標準溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以cAMP濃度為橫坐標，以cAMP峰面積為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程，計算R2值。

1.2.5.2 cAMP含量的測定 用蒸餾水浸提蘋果肉渣所獲得的樣品溶液記為W，分為3組：W1、W2、W3，過0.45μm濾膜，分別進樣測定；用20%乙醇浸提蘋果肉渣所獲得的樣品溶液記為A，分為3組：A1、A2、A3，過0.45μm濾膜，分別進樣測定。根據下式，計算出樣品中cAMP的質量含量：

式中：V為制備樣品溶液濃縮后定容后的體積，m L；C為HPLC測定樣品溶液中cAMP濃度，μg/m L；M為制備樣品溶液所用樣品的質量，g。

1.2.6 精密度實驗 吸取同一濃度的樣品溶液，過0.45μm濾膜，分別進樣5次測定，測定樣品中cAMP峰面積，并計算其cAMP濃度，計算RSD值。

1.2.7 重復性實驗 吸取同一批稀釋后的樣品溶液，過0.45μm濾膜，分別進樣5次測定，測定樣品中cAMP峰面積，并計算其cAMP濃度，計算RSD值。

1.2.8 加樣回收率實驗 精密吸取5份已測定cAMP含量的樣品溶液，每份1m L，分別加入0.5m L濃度為5.72μg/m L的cAMP標準品溶液，搖勻，過0.45μm濾膜，進樣測定峰面積，按照下式計算加樣回收率，并計算RSD值：

式中：m0為cAMP的測定量，μg；m1為cAMP加入量，μg；m2為樣品中cAMP含量，μg。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇 流動相選擇為：甲醇-含0.05moL/L磷酸二氫鉀的雙蒸水（體積比10∶90），流速1.0m L/m in，檢測室溫度為正常室溫，進樣量為20μL。

2.1.2 檢測波長的選擇 對cAMP標準品溶液進行紫外全波長掃描，掃描結果如圖1所示。圖1表示，cAMP在波長為209nm和259nm處有最大吸收峰，但是在210nm以下，溶液中氧氣亦有吸收，故而產生誤差，所以選擇259nm作為檢測波長。

圖1 cAMP標準品掃描圖譜Fig.1 The scanningmap of cAMP standard substance

2.2 cAMP的定性檢測結果

本研究采用保留時間法定性，結果如圖2所示。圖2表明，樣品中有組分與cAMP標準品的保留時間一致，大約為3.4m in，并且樣品中的目標峰與其他峰分離效果較好，故證明樣品中的目標峰為cAMP的峰。

2.3 cAMP定量檢測結果

本研究所得線性回歸方程為y=0.3294x。其中以峰面積為y軸，以cAMP質量含量為x軸，所得標準曲線如圖3所示，相關系數R2=0.9997大于0.99，呈良好線性關系，以5倍音噪比計算，該方法的檢出限為0.0900μg/g。

圖2 cAMP標準品及樣品中cAMP色譜圖Fig.2 The chromatograms of cAMP standard substance and sample

圖3 標準曲線圖Fig.3 The figure of standard curve

樣品中cAMP含量的測定結果如表1所示。表1顯示，用蒸餾水浸提（序號中的W1、W2、W3）制備樣品溶液，測定蘋果渣中cAMP含量為（225.8401±4.9221）μg/g；用20%乙醇溶液浸提（序號中的A1、A2、A3）制備樣品溶液，測定蘋果渣中cAMP含量為（132.5300±5.4507）μg/g。由此可見，對于蘋果渣不同的處理方式會影響到cAMP含量測定的結果，浸提液中添加乙醇可能會降低cAMP的溶出，使測定結果偏低。所以測定蘋果渣中cAMP的含量時，最好選用蒸餾水浸提制備樣品溶液。

表1 HPLC測定不同處理方式蘋果渣中cAMP含量結果Table1 HPLC determination of the cAMP content in apple pomace by different treatments

2.4 精密度實驗結果

cAMP標準品溶液精密度實驗結果見表2。發現相對標準偏差RSD=1.01%（n=5）小于2%，所以本研究精密度較好。

表2 精密度實驗結果Table2 The results of precision test

2.5 重復性實驗結果

蘋果渣樣品溶液重復性實驗結果見表3。發現相對標準偏差RSD=1.67%（n=5）小于2%，所以本研究重復性較好。

表3 重復性實驗結果Table3 The results of repeatability test

2.6 回收率實驗結果

表4 回收率實驗結果Table4 The results of recovery rate test

蘋果渣樣品溶液回收率實驗結果見表4。發現平均回收率為97.64%，相對標準偏差RSD=1.92%（n=5）小于2%，所以本研究回收率較好。

3 討論

本研究用水提取、乙醇提取兩種方式進行蘋果渣中cAMP提取，并運用HPLC測定了蘋果果渣中cAMP的含量。水浸提和乙醇浸提方法，已是活性物質提取中常用的方法，我們借鑒了棗中cAMP的提取方式[9，16-17]，對蘋果渣采取了兩種浸提方式。

目前對于動植物中cAMP檢測方法有紙色譜法、薄層色譜法、蛋白結合法、放射免疫法和高效液相色譜法。其中，紙色譜法操作繁瑣其時間長、靈敏度低；薄層色譜法具有操作方便、設備簡單、顯色容易、展開速率快等特點，較紙色譜法效果好，但常被用于對樣品的粗測，分離效果不及HPLC；放射免疫法需要借助液體閃爍計數儀，并要與蛋白結合法一起進行，造價比較高，試劑要求比較嚴格。因此，本文選用了目前應用最多的HPLC色譜分析方法，對蘋果渣中cAMP進行定性、定量分析。

本研究在蘋果渣cAMP定量分析中得到，用蒸餾水浸提制備樣品溶液中的cAMP含量為（225.8401± 4.9221）μg/g，用20%乙醇溶液浸提制備樣品溶液中的cAMP含量為（132.5300±5.4507）μg/g。與劉孟軍等[10]運用放射免疫法測定蘋果鮮果中cAMP含量為（336.00±95.15）pmol/g相差較大，這可能與測定方法不同、蘋果材料不同等有關系。本研究中水提取所得的cAMP含量明顯高于乙醇提取方式，是因為cAMP有3種異構體，每種異構體有順、反兩種構象，在溶液體系中cAMP共有6種穩定的構象，且各種異構體和構象處于一種快速的動態平衡過程[18]；經分析，一是由于cAMP在水溶液中的溶解度比在一定濃度乙醇溶液中的溶解度高；二是由于cAMP的6種不同的分子結構在蒸餾水浸提液中的優勢構象與在一定濃度乙醇溶液中的優勢構象不同，所以溶劑化作用不同，從而導致測定結果有明顯差異。然而樣品溶液體系對cAMP含量影響的具體因素與機理，還有待于進一步深入研究。另外，本研究所得蘋果渣中cAMP含量與棗中cAMP含量也明顯不同，主要因為種屬不同。張明娟等[9]用HPLC測定了8種棗果中cAMP的含量，cAMP含量最高為375.61μg/g，最低為46.01μg/g；而且發現在一定乙醇濃度范圍內，隨著乙醇濃度的增大，棗果中cAMP的提取率明顯降低，與本研究結果有相同的趨勢。王麗霞等[19]用和田玉棗進行了cAMP的提取與分離純化的研究，最高提取率為72.3%，獲得cAMP純度為3.47%；夏泉鳴等[20]研究了紅棗中cAMP提取工藝，最終得到cAMP提取率為65.0%，cAMP純度為37.5%。本研究中，蘋果果渣cAMP含量為225.8401μg/g，雖比棗果中cAMP含量375.61μg/g稍低，但對于開展蘋果加工中果渣副產物的綜合利用、變廢為寶具有一定的實用價值，將為蘋果果渣中活性功能物質的開發開辟新的領域。

4 結論

本研究通過實驗，得出了HPLC測定蘋果渣中cAMP含量的色譜條件，并通過在該條件下進行了定性和定量檢測。采用保留時間法定性，相關系數R2為 0.9997；精密度實驗中RSD為1.01%；重復性實驗中RSD為1.67%；回收率實驗中cAMP平均回收率為97.64%，RSD為1.92%。采用蒸餾水的提取方式并利用HPLC測定了皇冠蘋果渣中的cAMP的含量為（225.8401±4.9221）μg/g；采用20%乙醇溶液的提取方式測定蘋果渣中cAMP含量為（132.5300±5.4507）μg/g；對于cAMP提取，更適合選用水提取方法。

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