康磚茶高效液相色譜指紋圖譜建立初探

胡 燕，齊桂年

（四川農業大學園藝學院，四川雅安625014）

黑茶是我國的六大基本茶類之一，屬于后發酵茶，生產歷史悠久，主產區有四川、湖南、湖北、貴州、云南、廣西等省，是我國邊疆少數民族的日常生活必需品[1-2]。四川黑茶是我國黑茶類的一個重要組成部分，分為南路邊茶和西路邊茶，其中的南路邊茶主要包括康磚茶和金尖茶[3]。康磚茶產于雅安，具有香氣純正，滋味尚濃醇，湯色紅褐、尚明，葉底棕褐稍花的品質特點[4]。不同種類的茶葉由于加工方式不同，內含化學成分差異明顯。組成康磚茶的原料復雜，經過一系列的加工工序后，內含物質如多酚類、咖啡堿、茶色素等的種類和含量均會發生變化；同時，原料拼配比例的不同也會對康磚茶成品的質量產生不同程度的影響；但目前對康磚茶質量的評價仍主要是測定水分、總灰分、水浸出物等理化指標并結合感官審評，難以全面反映其質量。

化學指紋圖譜是一種從整體上研究復雜物質體系的技術工具，目前已廣泛應用于中藥的真偽鑒別、質量控制、新藥開發等領域[5-6]，能全面反映物質的整體化學特征，體現其內在的整體質量，但應用于茶葉尤其是黑茶的研究較少[7-16]。本文采用雅安市八家康磚茶生產企業不同年份的共計48批康磚茶成品樣，優化了色譜條件和樣品的提取條件，初步建立了康磚茶的HPLC指紋圖譜，為康磚茶的鑒別和全面質量控制提供了一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗采用的康磚茶成品樣 取自2010～2012年四川省雅安市八家主要的康磚茶生產企業，每家企業每年取2個成品樣，連續取樣3年，共計48個樣品，樣品來源及出廠日期見表1；作為對照的甘露、黃芽、毛峰、茉莉花茶 產地均為雅安市；1個金尖茶成品樣 取自雅安市名山縣明陽茶廠；甲醇、乙腈 色譜純，美國Fisher公司；水 二次蒸餾水；無水乙醇、甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸 分析純，天津科密歐化學試劑開發中心；咖啡堿標準品 CAS號：58-08-2，購自中國標準物質中心。

LC-20A高效液相色譜儀 配有在線真空脫氣裝置、四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器，日本島津；LCsolution色譜工作站日本島津；超聲波清洗器 上海冠特超聲波儀器有限公司；電子天平 德國賽多利斯股份公司；臺式高速離心機 上海安亭科學儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；微型植物實驗粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 色譜條件

流動相A：0.3%甲酸水溶液；流動相B：乙腈。色譜柱：Zorbax SB-C18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm）。檢測波長：190nm～400nm。柱溫：35℃。流速：1.0m L/m in。分析時間：45min。梯度洗脫程序：0～3min，2%B～5% B；3～5m in，5%B～12%B；5～10m in，12%B～16%B；10～16min，16%B～23%B；16～25min，23%B～26%B；25～35m in，26%B～30%B；35～40min，30%B～50%B；40～45m in，50%B～2%B。系統平衡色譜柱時間：15m in。

1.3 樣品前處理

稱取2.000g粉碎茶樣（康磚茶樣品先用茶刀敲碎后用微型植物實驗粉碎機打成粉末，過40目篩）于250m L具塞錐形瓶中，加入90℃蒸餾水，立即移入90℃水浴中浸提15m in，每隔5m in搖動一次。浸提完畢后冷卻至室溫，離心15m in（轉速4000r/m in），取上清液用0.45μm水相濾膜過濾后上機分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度實驗 取同一份供試品的水提取物溶液在1.2的色譜條件下連續進樣6次，以19號峰（見圖6）為參照峰，HPLC圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.37%～1.21%和0.58%～1.76%，表明儀器的精密度良好。

2.1.2 重復性實驗 取同一康磚茶樣品5份，按1.3的前處理方法平行制備，在1.2的色譜條件下分別進樣檢測，以19號峰為參照峰，測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.83%～1.67%和0.79%～1.98%，表明該提取方法的重復性良好。

表1 康磚茶的樣品來源及出廠日期Table1 Sample source of kang zhuan tea and delivery date

2.1.3 穩定性實驗 取同一份康磚茶樣品，按1.3的前處理方法獲得水提取物溶液，分別在0、2、4、8、12、16、20、24h不同時間點，按1.2的條件進樣檢測，測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.93%～1.81%和1.03%～2.27%，表明樣品提取液在24h內穩定。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 流動相的選擇 黑茶所含的化學成分復雜，在進行HPLC分析時只有選擇合適的流動相才能提高樣品中各色譜峰的分離度，增強響應值，降低基線噪聲。有研究表明，在酸性體系下可防止茶葉中兒茶素類的氧化[17]。該實驗選用不同濃度的甲酸、乙酸、三氟乙酸和磷酸水溶液分別作流動相A；選用乙腈、甲醇分別作流動相B，采用不同比例進行梯度洗脫。結果表明，當選用0.3%甲酸水溶液作流動相A，乙腈作流動相B，并以1.2所示梯度進行洗脫時樣品色譜峰的分離度較好，基線平穩。

2.2.2 檢測波長的選擇 通過二極管陣列檢測器在190～400nm波長范圍內進行掃描，發現檢測波長為230nm和280nm時色譜圖中出現的色譜峰數量較多，其中280nm波長處各色譜峰的分離良好且基線平穩，因此在進行指紋圖譜測定時選擇280nm作為檢測波長。

2.2.3 柱溫和流速的選擇 在其他實驗條件不變的前提下，只改變色譜柱的溫度，柱溫分別設置為25、30、35、40℃。HPLC結果顯示，隨著柱溫的升高出峰時間稍有提前，但對色譜圖整體的出峰情況影響不大（圖1）。結合各主要色譜峰的分離情況綜合考慮，最終選擇柱溫為35℃。

圖1 康磚茶提取液在不同柱溫下的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of kang zhuan tea under different column temperature

在其他實驗條件不變的前提下，只改變流動相的流速進行梯度洗脫，流速分別設置為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8m L/min。HPLC結果顯示，當流速較低時分析時間長，色譜峰變形和拖尾，分離度較低；隨著流速的提高，各色譜峰的出峰時間逐漸提前；當流速為1.0m L/m in時，各色譜峰的分離度最好；之后隨著流速的繼續提高，柱壓升高，各色譜峰的分離度逐漸下降（圖2）。

2.2.4 梯度洗脫程序的選擇 康磚茶內含成分復雜，不適合采用等度洗脫，該實驗考察了不同的梯度洗脫程序對康磚茶樣品各色譜峰分離度的影響。在充分保證基線穩定、色譜峰能達到較好分離并且節省分析時間的前提下，最終選擇了1.2中所述的梯度洗脫程序進行HPLC指紋圖譜測定。

圖2 不同流速下的HPLC圖Fig.2 The HPLC chromatograms under different flow velocity

2.3 樣品提取條件的優化

2.3.1 提取溶劑的選擇 選擇不同濃度的乙醇、甲醇、乙腈以及二次蒸餾水共16種溶劑對同一份康磚茶樣品進行提取，不同提取溶劑所得色譜圖的總峰面積結果見圖3。從圖3可以看出，用二次蒸餾水作為提取溶劑時所得色譜圖的總峰面積較大；同時，選用該溶劑提取康磚茶樣品時所得的色譜峰數目較多，用水浴提取也更符合飲茶習慣。

圖3 不同提取溶劑的總峰面積Fig.3 The total peak area of different solvents

2.3.2 料液比與提取時間的選擇 選取同一康磚茶樣品在90℃水浴中浸提15min，分別考察了1∶50、1∶70、1∶100、1∶150、1∶200的料液比對提取效果的影響；結果表明，在滿足良好分離度的前提下，當料液比為1∶70時得到的色譜圖峰形好，色譜峰的響應值較高。考察了提取時間（5、10、15、20、25、30、35、40、50、60min）對提取效果的影響；結果表明，當浸提15m in時所得到的色譜峰數目較多，之后再延長浸提時間，某些色譜峰的響應值反而略微降低，分析原因可能是隨著提取時間的延長，康磚茶中的某些化學成分發生了氧化分解。

2.4 康磚茶HPLC指紋圖譜的構建

2.4.1 參照峰及共有峰的選擇 選擇出峰時間適中、與相鄰峰的分離度較好、峰面積在色譜圖中所占比例較大的19號峰作為參照峰。經用咖啡堿標準物質溶液進樣分析，確認19號峰為咖啡堿。48批康磚茶成品樣的指紋圖譜見圖4。

圖4 48批康磚茶的HPLC指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprints of 48 batches of kang zhuan tea

將各色譜峰的保留時間與同一圖譜中參照峰的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間；各色譜峰按相對保留時間一一匹配后，選擇90%以上樣本共有的峰為樣本集的共有峰。該實驗最終選擇了34個共有峰，各共有峰的平均相對保留時間見表2。基于友誼茶廠的康磚茶（編號：S31）色譜峰總面積較大，峰數較多，將其指定為參比樣品，以求出其他樣品中各色譜峰i的相對峰面積Ar，其計算公式為Ar=（Ari/Ars）×100%，其中Ari為某樣品中某個色譜峰i的峰面積，Ars為參比樣品的總峰面積值。對八家企業康磚茶平均相對峰面積的聚類分析結果表明，當臨界值為15時，八家企業的樣品聚為3類，友誼、朗賽、和龍和蔡龍的樣品聚為一類，義興藏茶單獨為一類，吉祥、周公山和雅安茶廠的樣品聚為一類（圖5）。對48批康磚茶的指紋圖譜進行擬合，建立了對照指紋圖譜共有模式（圖6）。

圖5 八家生產企業康磚茶樣品的系統聚類分析圖Fig.5 Dendrogram of kang zhuan tea samples from eight production enterprises using cluster analysis

圖6 康磚茶HPLC指紋圖譜共有模式Fig.6 Common pattern simulated from HPLC fingerprints of kang zhuan tea samples

2.4.2 HPLC指紋圖譜的相似度評價 將48批康磚茶樣品的HPLC圖通過Lcsolution工作站以AIA格式導出，然后分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004A版）軟件中，先對同一企業不同生產年份的色譜圖進行擬合，分別建立八個廠家指紋圖譜的共有模式，再以48批樣品的對照指紋圖譜共有模式為參照，對八家企業的指紋圖譜共有模式進行相似度評價，從表3可知，八家企業的康磚茶指紋圖譜共有模式間的相似度在0.904～0.992之間，說明它們所含的化學成分極其相似，質量較穩定。而作為對照的甘露、黃芽、毛峰、茉莉花茶和金尖茶與康磚茶的相似度較低，說明不同原料和加工工藝對茶葉組分的影響較大。

3 結論

表2 48批康磚茶樣品共有峰的平均相對保留時間Table2 The average relative retention time of common peaks of 48 batches of kang zhuan tea samples

本實驗利用優化的色譜條件和樣品提取條件對雅安市八家主要康磚茶生產企業2010～2012年的共計48批康磚茶樣品進行了HPLC指紋圖譜研究，確認19號峰為咖啡堿，選擇其作為參照峰，建立了對照指紋圖譜共有模式。八家企業的康磚茶樣品與對照指紋圖譜共有模式的相似度在0.901～0.992之間，該結果表明八家不同企業的樣品中主要色譜峰的整體圖貌基本一致，說明質量較穩定。對八家企業康磚茶平均相對峰面積的聚類分析結果表明，當臨界值為15時，八家企業的樣品可聚為3類。本實驗所建立的HPLC指紋圖譜能在一定程度上為康磚茶質量的客觀評價和控制提供科學依據。

表3 不同廠家康磚茶樣品的相似度Table3 The similarity of kang zhuan tea samples from different production enterprises

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