高壓二氧化碳對鮮榨梨汁殺菌效果及動力學研究

廖紅梅，丁占生，鐘 葵，龍飛翊，廖小軍

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京100193；3.瀏陽市質量監督檢驗及計量檢定所，湖南瀏陽410300；4.國家果蔬加工工程技術研究中心，北京100083）

鮮榨梨汁具有清新的天然風味和較高營養價值，含有多種人體必需氨基酸、維生素及豐富的礦物質。梨汁可以清熱解毒、平喘止咳，深受人們歡迎[1]。但鮮榨梨汁中含有許多微生物，易引起腐敗變質，需要通過殺菌處理以達到保質目的。

高壓二氧化碳（High pressure carbon dioxide，HPCD）技術是一項具有極大潛力的新型殺菌技術。前期大量研究將HPCD應用到成分單一的液態媒介中，例如各種培養基、緩沖液和生理鹽水。隨著研究深入，逐漸將其應用到成分復雜的食品體系，主要是各種果蔬汁、牛奶和啤酒等。例如，Parton等[2]采用多批間歇式HPCD處理系統（multi-batch apparatus）對梨汁中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進行殺菌，在9MPa，32℃或38℃下處理24m in釀酒酵母降低了6.53個對數。Liao等[3]采用間歇式HPCD處理系統對蘋果濁汁中大腸桿菌（Escherichia coli）進行殺菌，在30MPa，42℃下處理75m in能使其中大腸桿菌降低7.6個對數，達到完全滅菌。但這些研究主要是針對在各種液態體系中接入單一種類微生物，僅有少量研究涉及到食品體系中的自然微生物群[4]。已有研究包括對橙汁[5-6]、葡萄汁[4，7]、蘋果汁[8]和荔枝汁[9]中細菌菌落總數、霉菌和酵母總數的殺菌效果研究。目前還沒有采用HPCD對鮮榨梨汁中自然微生物進行殺菌處理的研究。

本文以鮮榨梨汁為原料，研究HPCD技術對梨汁中細菌菌落總數的影響，并采用Weibull分析HPCD殺菌動力學過程，旨在為HPCD在鮮榨梨汁中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨梨 市售新鮮鴨梨；營養瓊脂培養基 北京奧博星科技有限公司。

高壓二氧化碳裝置 江蘇華安科研儀器有限公司；ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；DHP-9082型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD型無菌操作臺 蘇州尚田潔凈技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鴨梨汁的制取 市售新鮮鴨梨，清水清洗表皮、切成1cm3小塊，立即用0.3%抗壞血酸護色液浸泡并榨汁，隨后采用四層紗布（相當于200目絹布）過濾。取得梨汁混勻后于4℃冷藏備用，冷藏時間不超過8h。

1.2.2 高壓二氧化碳處理鴨梨汁 取出在4℃冷藏的鮮榨梨汁（初始細菌菌落總數為102～103CFU/m L），在無菌操作臺中無菌操作量取25m L梨汁于已滅菌的50m L塑料離心管中，每個處理準備3個離心管，共75m L。立即將分裝好的樣品置于已經預熱好的高壓二氧化碳處理釜中。密閉處理釜后進行升壓，達到設定壓強后進行保溫、保壓處理一定時間，緩慢卸壓并將裝有梨汁的離心管取出，放置無菌瓶中在冰箱中冷卻，以備測定梨汁中細菌菌落總數。同時做熱處理對照，即在不通入高壓CO2的條件下，采用與HPCD處理一致的溫度、時間、加樣量條件處理鮮榨梨汁，并測定其中細菌菌落總數。

1.2.3 微生物數量測定 采用平板計數法測定微生物數目。將菌液用0.85%生理鹽水以10倍稀釋法進行逐級稀釋，根據細菌數量選擇合適的稀釋度進行逐級稀釋，吸取連續3個不同稀釋度的稀釋樣1.0m L于滅菌平皿中，倒入約15m L營養瓊脂培養基，搖勻后在（37±0.1）℃條件下培養24h。并記錄菌數。

殺菌效果采用殘活率對數值（LogN/N0）表示，其中：N0為HPCD處理前的初始微生物數量（CFU/m L）；N為HPCD處理后的微生物數量（CFU/m L）。

1.2.4 梨汁中微生物殺菌效果動力學模型分析 采用Weibull模型，該模型由Weibull等[10]于1951年提出：

式中：N0為HPCD處理前的初始微生物數量（CFU/m L）；N為HPCD處理后的微生物數量（CFU/m L）；a和b分別為比例因子和形狀因子，t為處理時間。

1.2.5 數據統計分析 所有實驗均重復三次，數據采用方差分析（ANOVA）。數據采用Origin 7.5進行統計并繪圖。

2 結果與分析

2.1 HPCD處理中壓強和溫度對梨汁中細菌菌落總數活性的影響

圖1 HPCD處理壓強、溫度對梨汁中細菌菌落總數活性影響Fig.1 Effectof pressure and temperature on inactivation of totalaerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD for 50min

圖1表示HPCD處理中壓強、溫度對梨汁中細菌菌落總數活性的影響。

在相同壓強和處理時間的條件下，隨處理溫度升高，梨汁中菌落總數殘存率顯著下降（p＜0.05），表明HPCD處理時溫度具有協同殺菌效應：在20MPa下處理50m in，溫度分別為20、30和40℃時，梨汁中細菌總數分別降低了0.85、1.11和1.53個對數；在25MPa下處理50min，溫度分別為20、30和40℃時，梨汁中細菌總數分別降低了1.99、2.10和2.26個對數；在30MPa處理50m in，當溫度分別為20、30和40℃時，梨汁中細菌總數分別降低了2.26、2.41和2.65個對數。目前關于處理溫度能協同增強HPCD殺菌效果的解釋，一方面是，較高的溫度能促進CO2的溶解、利于其穿透細胞膜，從而提高HPCD對微生物的殺滅效果；另一方面是，處于臨界點附近的溫度改變能使亞臨界狀態CO2變為超臨界狀態，而超臨界狀態下CO2的溶解度和密度顯著增強，因此臨界點附近的溫度能提高殺滅效果[11]。

由圖1可知，隨著處理壓強升高，梨汁中菌落總數殘存率顯著下降（p＜0.05）。在30℃條件下處理50m in，當處理壓強分別為20、25和30MPa時，梨汁中細菌菌落總數分別降低了1.11、2.10和2.41個對數。這與已有研究結果一致[12-13]。主要是由于較高的壓強一方面能夠提高CO2滲透性和溶解能力，增加CO2與微生物細胞內部物質的接觸；另一方面也提高了對細胞的機械損傷，使微生物細胞壁和細胞膜破損而致死[14]。

2.2 HPCD處理時間對梨汁中菌落總數活性的影響

圖2～圖4，為不同溫度、壓強條件下隨著處理時間延長，HPCD處理和熱處理對梨汁中細菌菌落總數的殺菌曲線。在40℃條件下處理20min，熱處理和HPCD（30MPa）處理分別使梨汁中細菌菌落總數降低了0.08和1.57個對數；當處理時間延長到60m in時，熱處理和HPCD（30MPa）處理分別使梨汁中細菌菌落總數降低了0.18和2.66個對數。在相同溫度和處理時間條件下，HPCD處理的殺菌效果顯著高于熱處理殺菌效果（p＜0.05），且隨著處理時間延長，二者之間差距顯著增大。說明在HPCD處理過程中，溫度對其殺菌效果具有協同效應。

圖220℃下HPCD對鮮榨梨汁中菌落總數活性影響Fig.2 Inactivation of total aerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD at20℃

圖330℃下HPCD對鮮榨梨汁中菌落總數活性影響Fig.3 Inactivation of total aerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD at30℃

圖440℃下HPCD對鮮榨梨汁中菌落總數活性影響Fig.4 Inactivation of total aerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD at40℃

壓力和處理時間是影響HPCD殺菌效果的重要因素。研究表明，隨壓力的增大HPCD對細菌的鈍化作用也隨之增強，是因為壓力可以控制CO2的溶解速率以及溶解度，增加壓力可以使CO2溶解能力增強，利于HPCD萃取出細胞內生命物質，使微生物細胞破裂死亡[14]。同一溫度下隨處理壓力和處理時間增加HPCD的殺菌效果顯著增強（p＜0.05）。在20℃處理20m in，當壓強由20MPa升高至25MPa、30MPa時，梨汁中菌落總數分別下降了0.37和0.79個對數。表明隨壓力增加，殘存率顯著下降（p＜0.05）。這種殺菌效果隨著壓強升高而增強的趨勢在其他溫度下也很明顯。另一方面，當壓力20MPa時，隨處理時間增加菌落總數殘存率下降緩慢，從20m in增加到60m in時殘存率下降不到0.8個對數，表明殺菌效果較弱。在HPCD處理條件為30MPa、20℃、60m in時，鮮榨梨汁中自然菌落活菌率降低了2.36個對數（圖2）。

不同溫度下隨著處理壓力和時間的變化，HPCD的殺菌曲線呈現類似的變化趨勢。此外，較高溫度時，隨著處理時間的進一步延長，梨汁中菌落總數的下降趨勢減緩，表現為曲線逐漸變得較為平滑，如40℃、30MPa時，隨處理時間從50m in延長至60m in，微生物殘存率沒有顯著變化（p＞0.05）。其中，在HPCD處理條件為30MPa、40℃、60m in時，殺菌效果最好，使鮮榨梨汁中菌落總數的殘存率下降了2.66個對數。

2.3 HPCD對梨汁中菌落總數活性影響的動力學分析

表1 Weibull模型分析鮮榨梨汁中菌落總數殺滅效果的動力學參數Table1 Estimations of the kinetic parameters and R2 of inactivation of total aerobic bacteria in pear juice using the Weibullmodel

微生物殺菌動力學模型分析是研究殺菌技術的理論關鍵之一。利用食品預測微生物學方法和理論，通過研究加工因素、微生物因素和產品因素對HPCD殺菌過程的影響，建立預測模型和回歸方程，能更好地理解HPCD殺菌動力學及機理，提高其殺菌效果，確保食品安全[15]。果汁飲料中菌落總數變化的動力學分析和相關數學模型建立，對非熱加工技術實際應用具有較好的理論指導意義。在HPCD殺菌研究中，很多學者采用了一級動力學模型來分析殺菌過程。

根據圖2～圖4的殺菌曲線，本文采用Weibull模型分析和擬合HPCD對梨汁中菌落總數殺菌動力學過程。Weibull模型描述ln（N/N0）和處理時間t之間的相關性，以ln（N/N0）為y軸，處理時間t為x軸作圖，采用Origin 7.5進行數據的模型擬合并得到相關參數a和b。通常認為a因子是速度常數，b因子代表失活曲線的形狀。b＜1時失活曲線時凹面；b＞1時是凸面；b=1時是一條直線，即一級動力學反應[16]。結果表明（表1），Weibull模型能夠很好地擬合HPCD對菌落總數殺滅效果的動力學變化，相關系數均在0.9725以上，模型值和實驗值之間數值之間差異不顯著，表明能較好反映HPCD處理下菌落總數的失活曲線變化。隨壓力和處理溫度升高，比例因子a逐漸降低，表明隨溫度升高，壓力增大，菌落總數失活效果更加明顯；b值也呈現變小趨勢，表明失活曲線的凹面更加明顯，失活動力學不是簡單的一級動力學。

圖5 HPCD對梨汁中菌落總數殺菌效果Weibull模型預測值和實測值的比較圖Fig.5 Correlation between the experimental data and the predicted data obtained with themodel

圖5為殺菌效果的實驗值和Weibull模型值比較圖。由圖5可見，Weibull模型預測值和實測值的數值之間差異很小，相關系數R2都大于0.97，表明Weibull模型擬合度很高，能較好的反映HPCD處理下菌落總數的失活曲線變化。

3 結論

隨著處理溫度升高，梨汁中細菌菌落總數顯著降低（p＜0.05）；在相同溫度和處理時間條件下，HPCD處理的殺菌效果顯著高于熱處理殺菌效果，處理溫度對HPCD殺菌效果具有協同效應；隨著壓強升高、處理時間延長，HPCD對梨汁中細菌菌落總數的殺菌效果顯著增強（p＜0.05）；當HPCD處理條件為30MPa、40℃、60m in時，滅菌效果最佳，梨汁中細菌菌落總數的殘存率降低了2.66個對數。

Weibull模型能較好地擬合HPCD處理后梨汁中細菌菌落總數的失活曲線，隨壓力增加和溫度升高，模型動力學參數比例因子a和形狀因子b呈現逐漸變小的規律性變化。

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