20種川產道地藥材對番茄灰霉菌的抑制作用研究

劉鐵秋，孫雪丹，何 苗，羅 友，盧 勇，曾憲垠，*

（1.四川農業大學原子能農業應用研究室，四川雅安625014；2.四川農業大學生命科學與理學院，四川雅安625014；3.四川瑪思特農業開發有限公司，四川南充637105）

番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）侵染所致，該病危害番茄的整個生育期和全株，是一種世界性病害[1]。隨著番茄保護地種植面積的不斷擴大，該病并沒有得到全面有效的防治，其仍是番茄溫室病害及儲存番茄腐爛的重要因素[2-3]。由于尚未發現該病抗源，抗病育種難以進行，致使該病的控制、防治困難，其防治手段仍主要依靠化學殺菌劑[4]。灰葡萄孢繁殖迅速，可多次浸染并形成較高病原基數；其遺傳變異率高，極易產生抗藥性，雖然在化學防治上研究的很深入[5-7]，但只能輪換、交替或混合使用化學殺菌劑，才能取得較好的控制效果，而超量使用化學農藥又導致嚴重的“3R”問題。

中藥殺菌劑作為一種新型植物源農藥，對目標生物有安全無污染的特點[8]。因此，篩選對番茄灰霉病菌具有抑制作用的中藥材提取物越來越受到人們的關注，王樹桐等[9-10]對10種中藥材提取物進行抑菌篩選后，進一步研究了細辛、丁香提取物對番茄灰霉病菌的防治效果，王興全等[11]發現蒼耳提取物對番茄灰霉病有明顯抑制作用后，初步探討了其作用機理。目前，蛇床子、苦參、甘草、石榴皮等[12-14]數十種中藥材提取物對番茄灰霉病菌的抑制作用均有研究報道，而川產道地藥材對番茄灰霉病的抑菌效果研究少見報道，鑒于多種川產道地藥材具有殺菌抑菌潛力，本文通過對系統篩選出的20種具有殺菌抑菌潛力的川產道地藥材的乙醇、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、石油醚和水6種提取物進行番茄灰霉病菌的室內防治實驗，豐富中藥材提取物抑菌研究領域的數據資料，同時為最終找到新的可用于殺菌劑研發的中藥材料奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20種供試川道地藥材 通過《中華人民共和國藥典中藥材及原植物彩色圖鑒》《四川道地中藥材志》《中國土農藥志》《有毒中藥》《中國有毒植物》等相關文獻資料系統篩選，名錄見表1，均購于四川省成都北京同仁堂總府路店，50℃烘干，粉碎后過0.425mm孔徑篩，密封，4℃保存備用；番茄灰霉病菌（B.cinerea） 四川農業大學原子能農業應用研究室提供；無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、石油醚均為分析純 四川西隴化工有限公司；啶酰菌胺（50%水分散粒劑） 德國巴斯夫歐洲公司；甲基硫菌靈（70%可濕性粉劑） 浙江威爾達化工有限公司；PDA培養基 杭州微生物試劑有限公司。

GHP-9050型隔水式恒溫培養箱、DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；LQ-CTS1型恒溫振蕩器 上海瑯珄實驗設備有限公司；SW-CJ-1CU型潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；RE-2000B型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；MLS-3780-SV型高壓蒸汽滅菌器日本三洋電機株式會社；KQ3200DA型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BSA223S型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DL-1型萬用電爐 北京市永光明醫療儀器有限公司；FW-100型高速萬能粉碎機 齊家務科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物制備

1.2.1.1 有機試劑提取 采用浸漬法[15-16]。稱取9g中藥干粉，加90m L有機試劑，28℃，180r/m in振蕩提取24h，過濾，濾渣重復提取2次，合并3次濾液，旋轉蒸發濃縮至9m L，即1m L提取物相當于1g原藥，密封后保存于4℃冰箱備用。

1.2.1.2 水提取 采用煎煮法[17-18]。稱取9g中藥粉末，加90m L蒸餾水浸泡2h，煮沸后文火保持1h，過濾，濾渣加50m L蒸餾水重復提取2次，合并3次濾液，旋轉蒸發濃縮至9m L，即1m L提取物相當于1g原藥，密封后保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 抑菌活性研究 采用菌絲生長速率法[19]。取提取物3m L，濾菌后加入27m L滅菌PDA培養基中制成質量濃度為0.1g/m L的含藥平板。在平板中央接種直徑為5mm的菌餅，菌絲面朝上，每個處理3次重復，接種后23℃恒溫培養。以無菌水為空白對照，以對應溶劑、甲基硫菌靈（1∶800）和啶酰菌胺（1∶1000）為對照。培養7d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，并按下式計算菌絲生長抑制率：

1.2.3 數據處理 本實驗數據菌落直徑采取三次重復平均值±標準誤（mean±SEM）表示，應用PASW Statistics 18軟件進行鄧肯式（Duncan）新復極差分析（One-way ANOVA）法[20]統計分析。

2 結果與分析

2.1 乙醇提取物抑菌作用

表1 供試藥材名錄Table1 Catalogue of tested Sichuan authentic herbalmedicine

采用生長速率法測定了20種川道地藥材乙醇提取物對番茄灰霉病菌的抑制作用，結果見表2。由表2可見，在提取物質量濃度為0.1g/m L的條件下，供試藥材乙醇提取物均有抑菌效果，其中抑菌率超過75%的13種供試藥材具有明顯相當于或優于化學殺菌劑的抑菌效果；黃柏、川射干、花椒、黃連、石菖蒲、大黃、川烏7種供試藥材抑菌率為100%，抑菌效果顯著性高于抑菌率為92.22%的甲基硫菌靈；金銀花抑菌效果顯著性高于抑菌率為82.35%的啶酰菌胺；川木通、桔梗、半夏、川楝子、續斷5種供試藥材抑菌效果與啶酰菌胺無顯著性差異；乙醇與無菌水對照無顯著性差異，說明本實驗條件下無水乙醇無抑菌作用。

2.2 乙酸乙酯提取物抑菌作用

采用生長速率法測定了20種川道地藥材乙酸乙酯提取物對番茄灰霉病菌的抑制作用，結果見表3。由表3可見，在提取物質量濃度為0.1g/m L的條件下，供試藥材乙酸乙酯提取物均有抑菌效果，其中7種供試藥材抑菌效果顯著性高于抑菌率為83.18%的啶酰菌胺；川射干、黃連、桔梗、石菖蒲、川烏、使君子抑菌率為100%，抑菌效果顯著性高于抑菌率為95.60%的甲基硫菌靈；乙酸乙酯對照組在本實驗條件下無抑菌作用。

2.3 丙酮提取物抑菌作用

采用生長速率法測定了20種川道地藥材丙酮提取物對番茄灰霉病菌的抑制作用，結果見表4。由表4可見，丙酮對照組具有一定的抑菌作用，抑菌率為17.87%，與使君子、巴豆、半夏、金錢草、附子、桔梗、川木通無顯著性差異，表明該7種供試藥材丙酮提取物無抑菌作用；丙酮對照組抑菌率顯著高于白芍、川牛膝、澤瀉，表明該3種供試藥材丙酮提取物在本實驗條件下對番茄灰霉病菌略有促進生長作用；在提取物質量濃度為0.1g/m L的條件下，石菖蒲的抑菌率為100%，顯著高于抑菌率為92.65%的甲基硫菌靈；大黃抑菌率為87.86%，顯著高于抑菌率為82.66%的啶酰菌胺，與甲基硫菌靈無顯著性差異；川射干抑菌效果與啶酰菌胺無顯著性差異，以上3種供試藥材抑菌效果較為顯著。

2.4 三氯甲烷提取物抑菌作用

表2 20種川產道地藥材乙醇提取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用Table2 Inhibitory effects of 20 species of alcoholic extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

表3 20種川產道地藥材乙酸乙酯提取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用Table3 Inhibitory effects of 20 species of ethyl acetate extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

采用生長速率法測定了20種川道地藥材三氯甲烷提取物對番茄灰霉病菌的抑制作用，結果見表5。由表5可見，在提取物質量濃度為0.1g/m L的條件下，供試藥材三氯甲烷提取物均有抑菌效果，三氯甲烷抑菌率為8.94%，不影響供試藥材抑菌效果的對比；續斷、金銀花抑菌率為100%，抑菌效果顯著高于甲基硫菌靈；石菖蒲抑菌效果與甲基硫菌靈無顯著性差異；半夏抑菌效果顯著高于啶酰菌胺；黃連抑菌效果與啶酰菌胺無顯著性差異，以上5種供試藥材抑菌效果顯著。

表4 20種川產道地中藥材丙酮提取物對番茄灰霉菌菌絲生長的抑制作用Table4 Inhibitory effects of 20 kinds of acetonic extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

表5 20種川產道地藥材三氯甲烷提取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用Table5 Inhibitory effects of 20 species of trichloromethane extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

2.5 石油醚提取物抑菌作用

采用生長速率法測定了20種川道地藥材石油醚提取物對番茄灰霉病菌的抑制作用，結果見表6。由表6可見，在提取物質量濃度為0.1g/m L的條件下，供試藥材石油醚提取物除澤瀉外均有抑菌效果，但20種供試藥材石油醚提取物抑菌率均低于80%，效果均顯著低于甲基硫菌靈，只有石菖蒲抑菌效果較強，為79.04%，與啶酰菌胺無顯著性差異；由于石油醚具有強烈的揮發性，在本實驗條件下表現出較弱的抑菌效果，從而不影響各處理組實驗結果的比較。

2.6 水提取物抑菌作用

采用生長速率法測定了20種川道地藥材水提取物對番茄灰霉病菌的抑制作用，結果見表7。由表7可見，在提取物質量濃度為0.1g/m L的條件下，供試藥材水提取物除使君子、巴豆表現出較弱的促進作用外均有一定的抑菌效果，但20種供試藥材水提物的抑菌作用均顯著低于啶酰菌胺與甲基硫菌靈，抑菌率均在80%以下。

3 結論與討論

乙醇提取物中黃柏、川射干、花椒、黃連、石菖蒲、大黃、川烏、金銀花，乙酸乙酯提取物中川射干、黃連、桔梗、石菖蒲、川烏、使君子，三氯甲烷提取物中續斷、金銀花，丙酮提取物中石菖蒲對番茄灰霉病菌均有顯著的抑制作用，在供試濃度為0.1g/m L的條件，實驗測量抑菌率為100%。

前人對以上部分藥材提取物成分也做過一定研究，例如黃柏乙醇提取物中主要化學成分為γ-花椒堿、茵芋堿、鐵屎米酮等[21]，漢源花椒精油主要含D-檸檬烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯等[22]，石菖蒲的主要抑菌成分有α-細辛醚，細辛醛[23]等，但對供試藥材提取物具體抑菌成分分析及對番茄灰霉病菌等蔬菜病原真菌的抑菌效果研究的很少，能進一步研發為中藥殺菌劑的幾乎沒有，因此在本實驗基礎上，對以上具有顯著抑菌作用的供試藥材作抑菌成分分析，或研究配伍抑菌效果，并進一步研發中藥殺菌劑是可行的。

表6 20種川產道地藥材石油醚提取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用Table6 Inhibitory effects of 20 species of petroleum ether extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

表7 20種川產道地藥材水提取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用Table7 Inhibitory effects of 20 species of aqueous extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

通過6種溶劑提取物抑菌實驗結果來看，由于各種溶劑提取的極性部位不同，使得提取溶劑的選擇對供試藥材提取物抑菌效果有顯著的影響。石油醚、氯仿提取的是小極性部位，乙酸乙酯適于提取中等極性部位，乙醇、丙酮適于提取極性很大的苷類、糖類、氨基酸與某些生物堿[9]。水提物因煎煮溫度高導致破壞活性物質，糖分含量高導致濃縮后易凝聚沉淀等因素造成抑菌效果較差。因此，在中藥材提取物室內抑菌實驗中，根據中藥材成分選擇適當的溶劑有利于提高篩選效果。

目前，生產中單一和過量用藥都有利于病菌抗藥性的產生。灰葡萄孢菌是典型的易產生抗藥性的病菌。目前市面上，針對它的殺菌劑主要有苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯胺基嘧啶類、咯菌腈等。但已有報道指出番茄灰霉病菌對這些殺菌劑產生了不同程度的抗藥性[24]。本實驗結果表明，川道地藥材黃柏、川射干、花椒、黃連、石菖蒲、大黃、川烏、金銀花、桔梗、使君子、續斷等均可用于防治番茄灰霉病的中藥殺菌劑研發。

[1]E M Soylu，SKurt，SSoylu.In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato greymould disease agent Botrytis cinerea[J].International Journal of Food Microbiology，2010，143（3）：183-189.

[2]V Decognet，F Ravetti，CMartin，et al.Improved leaf pruning reduces development of stem cankers caused by grey mould in greenhouse tomatoes[J].Agronomy for Sustainable Development，2009，30（2）：465-472.

[3]N Sadfi-Zouaoui，B Essghaier，M R Hajlaoui，et al.Ability of moderately halophilic bacteria to control grey mould disease on tomato fruits[J].Journal of Phytopathology，2008，1561：43-52.

[4]W Yifei，Y Ting，X Jindan，etal.Biocontrol of postharvestgray mold of cherry tomatoes with the marine yeast Rhodosporidium paludigenum[J].Biological Control，2010，53：178-182.

[5]J Sobolewski，J Robak.New fungicides used for complex control of diseases on tomato growing in the field and in the greenhouse[J].Progress In Protection，2002，42（2）：162-167.

[6]M Tadesse，U Steiner，H Hindorf，et al.Bryophyte extracts with activity against plant pathogenic fungi ethiopian[J].Journal Of Science，2003，26（1）：55-62.

[7]T Nagata，K Masuda，SMaeno，et al.Synthesis and structure activity study of fungicidal anilinopyrimidines leading to mepanipyrim（KIF-3535）as an anti-botrytis agen[J].Pest Management Science，2004，60（4）：399-407.

[8]嚴振，莫小路，王玉生.中草藥源農藥的研究與應用[J].中國中藥雜志，2005，30（21）：1714-1717.

[9]王樹桐，胡同樂，張風巧，等.中藥細辛提取物對番茄灰霉病菌的抑菌作用及防病效果研究[J].河北農業大學學報，2006，29（1）：59-62.

[10]王樹桐，曹克強，張風巧，等.中藥丁香提取物對番茄灰霉病菌的抑菌作用及生防效果[J].植物病理學報，2005，36（1）：91-94.

[11]王興全，張新虎，楊順義，等.蒼耳提取物對番茄灰霉病菌抑制機理的研究[J].甘肅農業大學學報，2008，43（3）：107-110.

[12]周寶利，尚淼，孟思達，等.蛇床子提取物對番茄灰霉病菌的抑制效果[J].西北農業學報，2012，21（2）：137-141.

[13]周寶利，劉雙雙，靳曉冬，等.苦參提取物抑制番茄灰霉病菌活性的研究[J].沈陽農業大學學報，2012，43（2）：143-147.

[14]黃奔立，朱華，顧艷，等.中草藥對5種蔬菜病菌的抑制作用[J].揚州大學學報：農業與生命科學版，2006，27（3）：84-86.

[15]曾建國.植物提取物標準化研究方法與示范[M].北京：化學工業出版社，2011.

[16]唐艷，張賓，霍健聰，等.12種中草藥抑菌作用研究[J].浙江海洋學院學報：自然科學版，2012，31（2）：147-152.

[17]N Thuille，M Filler，M Nagl.Bactericidal activity of herbal extracts[J].International Journal of Hygiene and Environmental Health，2003，206（3）：217-221.

[18]周立剛.植物抗菌化合物[M].北京：中國農業科學出版社，2005.

[19]吳文君.植物化學保護實驗技術導論[M].西安：陜西科學技術出版社，1988.

[20]齊軍山，辛志梅，李林，等.應用SPSS軟件進行農藥實驗數據的統計分析[J].山東農業科學，2008（7）：100-104.

[21]李行諾，翟文豐，周孟宇，等.黃柏化學成分研究[J].浙江工業大學學報，2012，40（3）：244-246.

[22]祝瑞雪，曾維才，趙志峰，等.漢源花椒精油的化學成分分析及其抑菌作用[J].食品科學，2011，32（11）：85-88.

[23]H S Lee.Fungicidal property of active component derived from Acorus gramineus rhizome against phytopathogenic fungi[J].Bioresource Technology，2007，98（6）：1324-1328.

[24]紀軍建，張小風，王文橋，等.番茄灰霉病防治研究進展[J].中國農學通報，2012，28（31）：109-113.