傳統魚露發酵液中優勢乳酸菌的分離、純化與初步鑒定

張 豪，章超樺，曹文紅，李瑞杰

（廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

魚露（fish sauce）亦稱魚醬油，其營養豐富，味道鮮美，是我國東南沿海、日本以及東南亞一帶的傳統調味料，在國內又以潮汕魚露最為典型[1]。傳統的魚露生產是鹽漬和發酵兩者相結合的產物，即利用鹽漬抑制腐敗微生物，通過魚體自身的蛋白酶以及微生物的共同作用進行水解的過程，從而達到生產魚露的目的[2]。眾所周知，魚露在前期鹽漬自溶的基礎上，通過中后期長期的陳化，慢慢形成魚露所特有的風味。乳酸菌作為魚露中后期發酵的優勢菌，其變化與魚露的各項理化指標及游離氨基酸的變化有著密切的聯系，并對魚露風味的形成有著積極的貢獻[3-5]。而目前對魚露中后期風味形成有著密切聯系的優勢菌——乳酸菌研究還比較少。

本實驗旨在通過對后期發酵液的不同階段（12、15、18、21、24個月）中乳酸菌的分離鑒定，從而獲得貫穿整個發酵中后期的優勢菌種，并研究其生化特性及酶活性。以期對中后期乳酸菌種類、特性有一定的了解，為進一步探究乳酸菌對魚露風味的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傳統魚露發酵樣品 發酵周期為兩年，以藍圓鲹為原料，與一定比例的海鹽混合，在（30±5）℃下分別已自然發酵12、15、18、21、24個月，由廣東省汕頭魚露廠有限公司提供；分離培養基、MC固體培養基、MRS固體培養基、明膠液化培養基、吲哚實驗培養基、H2S產生實驗、硝酸鹽還原實驗的培養基、糖醇類碳源發酵管 北京陸橋技術有限責任公司；NaCl等試劑 均為分析純，廣州化學試劑公司。

表1 5個分離菌株的形態特征Table1 Characteristics of five isolated strains

01J2003-04立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司；sky-1102C恒溫培養搖床 上海蘇坤實業有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SLI-700恒溫培養箱 上海愛朗儀器有限公司；PHS-2pH計 上海精科；UX2200H電子天平 SHIMADZU CORPORATION JAPAN；L1100雙目微生物顯微鏡 廣州市廣精精密儀器有限公司；島津UV-2550紫外可見分光光度計日本島津公司。

1.2 實驗方法[6-7]

1.2.1 發酵液樣品的采集 傳統魚露發酵過程是一個開放的環境，因此，在取樣時，要盡量避免外界空氣雜菌的影響，所取不同階段的發酵液均為距其上表面8～12cm處的樣品。

1.2.2 乳酸菌的分離 在MC固體培養基中，選取具有明顯數量優勢的菌株劃線分離，直到得到純菌株。純化后的菌株分別接種到MRS斜面培養基，置于4℃冰箱中保存備用。

1.2.3 乳酸菌的鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定 將分離純化后的菌株涂布到MRS固體培養基上，（35±0.2）℃下培養48h，觀察菌落特征，取典型菌落進行革蘭氏染色，并在油鏡下觀察菌體形態。

1.2.3.2 生理生化實驗 對分離后的菌株進行接觸氧化酶實驗、產H2S實驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖產氣實驗；用半固體培養基測定菌株的運動性。

1.2.3.3 糖醇類發酵實驗 通過菌株的糖醇類發酵實驗，檢驗分離菌株對各種糖醇類碳源的利用情況。

1.2.3.4 耐鹽實驗 將分離菌株接種于MRS肉湯培養基中，（35±0.2）℃下培養24h。吸取一定量菌株培養液接種到NaCl含量（質量分數）為0、3%、6%、9%、12%的MRS肉湯培養基中，（35±0.2）℃下培養48h，于650nm下測定OD值。

1.2.4 蛋白酶和脂肪酶活性實驗 采用添加10%脫脂乳的MRS固體培養基，分別滴入0.2m L的菌液涂布均勻，（35±0.2）℃培養48h。若有透明圈出現，則可判定該菌株有分解蛋白質的能力。采用添加10%豬油和中性紅指示劑的MRS固體培養基，分別滴入0.2m L的菌液涂布均勻，（35±0.2）℃培養48h。若有紅色斑點出現，則可判定該菌株有分解脂肪的能力。

1.2.5 優勢乳酸菌24h的生長曲線及產酸能力的測定 在MRS肉湯培養基中，分別接入經活化過的分離菌株，在（35±0.2）℃下振蕩培養，用分光光度計于波長650nm處每隔4h測定其吸光度值（OD值），連續測定24h，以不接種的MRS肉湯培養基作為對照，并同時對應測定其24h內的pH的變化情況。

2 結果與討論

2.1 中后期魚露發酵液中不同階段乳酸菌的分離鑒定

通過對兩年制魚露發酵液中后期不同階段乳酸菌的分離與鑒定，共分離獲得28種乳酸菌，其中有5種優勢乳酸菌貫穿整個魚露發酵的中后期，分別編號為R1、R2、R3、R4、R5，其形態特征及菌體特征見表1與圖1。

圖1 5個分離菌株的菌體形態（1000×）Fig.1 Cellmorphology of five isolated strains（1000×）

由表1、圖1可以看出，中后期魚露發酵液中的優勢乳酸菌多數為白色，菌落表面濕潤、光滑，邊緣整齊，均為革蘭氏陽性菌；個體形態不盡相同，桿狀、假分枝狀和球狀。

2.2 乳酸菌的生理生化鑒定結果

乳酸菌的生理生化反應與糖醇類發酵實驗結果分別見表2和表3。5種乳酸菌的接觸酶實驗均為陰性，不運動，不產H2S和吲哚，不液化明膠，可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖和半乳糖。5種菌株都不能利用鼠李糖和山梨糖。相比較而言，R1、R4的耐鹽性要強于R2、R3、R5。

根據菌體和菌落形態、生理生化實驗及糖醇類發酵實驗結果，對照《乳酸菌——生物學基礎及應用》[8]、《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[9]和《伯杰細菌鑒定手冊》[10]對菌株進行鑒定分析。鑒定結果為：R1為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、R2為德氏乳桿菌乳亞種（L.delbrueckii subsp.lactis）、R4為短乳桿菌（L.brevis）、R5為乳酸乳球菌乳亞種（L.lactis subsp.lactis），而R3未能鑒別出種屬。

表2 5個分離菌株的生化特性Table2 Biochemistry characters of five isolated strains

表3 糖醇發酵實驗結果Table3 Fermentation results of sugar and alcohol

2.3 乳酸菌對蛋白質和脂肪能力的測定

表4 蛋白質和脂肪降解活性Table4 Degradation activity of protein and fat

實驗中對分離的5株乳酸菌對蛋白質和脂肪的降解活性進行了分析，其結果見表4。魚露發酵的中后期是其風味形成的關鍵時期，發酵液中的乳酸菌如果具有蛋白質酶和脂肪酶活性，則可能引起腐敗、出現酸敗味等現象[11-12]。從表4可知，所分離的R1、R2、R3、R4、R5均不具有蛋白質酶活性和脂肪酶活性。

2.4 乳酸菌24h生長曲線及產酸能力的測定

由圖2可以看出，所分離的5種菌株在4h以后OD值明顯升高，進入對數生長期，在培養16h后，OD值均達到較高水平，此后變化幅度趨于平穩，說明菌種已進入生長穩定期。乳酸菌在發酵液中產生大量的乳酸、乙酸等，提高了酸度，從而抑制其他雜菌的生長，并能促進魯氏酵母等一些增香酵母菌的繁殖和發酵[13-14]，從而與酵母菌共同作用，形成魚露特有的風味。同時，產酸能力的大小也是衡量乳酸菌能否作為發酵劑的重要指標之一。由圖3可見，5株乳酸菌分別在MRS肉湯培養基中的整體pH都呈下降趨勢，期間前4h下降較緩慢，此后，菌液的pH急劇下降，16h后pH變化較小。相對而言，R3、R5的產酸能力較強，在培養24h后的pH為4.0左右。而R1、R4的產酸能力較弱，在培養24h后的pH為4.5左右。

圖2 菌液OD值隨時間變化曲線Fig.2 Changes in OD value of culturewith time

圖3 菌液pH隨培養時間變化曲線Fig.3 Changes in pH of culturewith time

3 結論

以發酵周期為兩年的傳統魚露發酵液為研究對象，分別對中后期不同階段（12、15、18、21、24個月）發酵液中的乳酸菌進行篩選。共分離獲得28種乳酸菌，其中至少有5種優勢乳酸菌貫穿整個發酵的中后期，分別是R1為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、R2為德氏乳桿菌乳亞種（L.delbrueckii subsp.lactis）、R4為短乳桿菌（L.brevis）、R5為乳酸乳球菌乳亞種（L.lactis subsp.lactis），R3未能鑒別出種屬。其中R1、R4的耐鹽性比較強，而R3、R5的產酸能力則相對較強。這5株乳酸菌均不具有對蛋白質和脂肪的降解能力。該結果進一步加深了對魚露發酵過程中乳酸菌種類、性質的了解，為下一步探討多菌種發酵魚露提供了一定的理論基礎。

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