不同菌種比例對發酵桑葉茶生物活性成分含量的影響

肖 洪，黃先智，丁曉雯，*，沈以紅，張亞瓊，梁菡峪，張 迪，丁順杰

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工重點實驗室，重慶400715；2.西南大學蠶學與生物系統研究所，重慶400715；3.家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶400715）

桑葉茶（Mulberry-leaf Tea）是由桑葉加工制作而成的新型茶品，目前一般采用直接烘干或自然發酵的方式生產。桑葉綠茶甘醇香甜；桑葉烏龍茶爽口醇和，有淡淡的花香；桑紅茶甘甜醇厚，有近似香蕉的果香味[1]。但桑葉綠茶普遍存在湯色發黑，豆腥味重，感官品質不佳的問題，為此，人們嘗試開發桑葉烏龍茶、紅茶等產品。桑葉茶的主要功能成分包括生物堿、茶多酚、花青素、綠原酸、白藜蘆醇、氧化芪三酚、β-胡蘿卜素等生物活性物質[2-3]。桑葉茶的礦物元素含量比茶葉高出3～6倍；總糖、酚類物質、氨基酸含量都較高；同時桑葉葉面較薄，比茶葉易溶解出更多的有效成分，有利于人體的吸收[4]。脫氧野尻霉素（Deoxynojirimycin，DNJ）是一種極性含N化合物，其化學名稱為3，4，5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶，分子式為C6H13NO4，相對分子質量為163[5-6]，是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，具有降血糖[7-8]、降血脂[9-10]、抗腫瘤[11]、抑制變形鏈球菌生長[12]、抗病毒[13]等功效。桑葉是植物中DNJ含量比較高的，但不同葉位、加工工藝等諸多因素都可能影響到桑葉茶中DNJ的含量[14-15]。黃酮類物質是一類天然的抗氧化劑，能夠清除人體中超氧離子、氧自由基、脂質過氧化物、過氧化氫及酶類所不能清除的羥自由基等，具有降血壓、抗氧化、防癌，抗炎、抗過敏、利尿、解痙、鎮咳、降血脂等生理作用[16]。桑葉中含有的多糖具有顯著的降血糖作用[17]，可以抑制α-葡萄糖苷酶和豬胰液α-淀粉酶的活性[18]等作用。前期實驗探究了不同菌種單獨或組合人工接種發酵對桑葉茶中DNJ、黃酮、多糖、多酚等主要功能成分含量的影響。發現黑曲霉、日本根酶、綠色木霉復合發酵制得的桑葉茶綜合品質好，本文以不同黑曲霉、日本根酶、綠色木霉菌種比例發酵桑葉茶，分析不同菌種比例對發酵桑葉茶中DNJ、黃酮、多糖、多酚4種功能成分含量變化，為桑葉的深度開發利用提供數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（AsPergillus niger） GSICC 60108，甘肅省微生物菌種保藏中心；日本根霉（Rhizopus japonicus Vuillem in） GIM 3.119，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；綠色木霉（Trichoderma viride）GIM 3.443，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心（注以上三種菌種的安全等級均高，其生物危害程度為四類，在通常情況下不會引起人類或者動物疾病）；自然發酵、人工發酵桑葉茶 由本實驗室自制；DNJ標準品 北京德威鈉生物技術有限公司；甘氨酸（Gly）、9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl） Sigma公司；乙腈 色譜純，天津市四友精細化學品有限公司；沒食子酸標準品 中國藥品生物制品檢定所；蘆丁標準品 北京德威鈉生物技術有限公司；其他常用試劑 均為分析純。

Waters 1525 HPLC 美國Waters公司；5810型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；Spectrum lab 22可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；KQ5200DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵桑葉茶的制備 采摘從頂芽往下數4～10片的新鮮桑葉，去柄，切為4cm×4cm的小葉片，混勻后稱取100g葉片用微波殺青90s，揉捻，根據中心組合設計，設置黑曲霉∶日本根酶∶綠色木霉為1∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2六種比例，加入107cfu的不同比例的黑曲霉+日本根酶+綠色木霉菌液10m L（自然發酵只加10m L無菌水），復揉，28℃發酵5h，微波干燥，制得桑葉茶。

1.2.2 DNJ的測定

1.2.2.1 測試樣品的制備 取桑葉茶粉末0.5g，加入一定量超純水，80℃水浴浸提2h（每20min搖勻一次），抽濾后，濾渣再加水浸提2次。合并浸提液，用超純水定容至50m L，即得樣品提取液。

1.2.2.2 DNJ的衍生化及測定方法 按照參考文獻[19]進行。色譜條件：色譜柱：C18柱（150mm×4.6mm×5μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸（50∶50，V/V）；流速：1.0m L/min；柱溫25℃；進樣量10μL；紫外檢測器，檢測波長254nm。

1.2.3 黃酮測定 取桑葉茶粉末0.5g于50m L離心管中，加70%乙醇15m L，80℃水浴160W功率超聲提取15min，7000r/min離心5min，抽濾，得到濾液。如此共提取3次，濾液用70%的乙醇定容至50m L。吸取1.0m L濾液，用AlCl3比色法[20]測定。

1.2.4 多糖測定 取桑葉茶粉末0.250g于蘭蓋瓶中，加入20m L沸蒸餾水，在200W功率下55℃超聲提取20m in，將提取液過濾后定容至25m L。取1.0m L濾液用苯酚-硫酸法[21]測定多糖含量。

1.2.5 多酚測定 按照GB/T 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[22]進行測定。

1.3 數據統計與分析

各實驗至少重復3次以上，實驗數據用Excel和SPSS 16進行統計處理。

2 結果與討論

2.1 各活性成分標準曲線線性回歸方程及相關系數

按照1.2.2的實驗方法，對不同濃度DNJ標準溶液進行測定，得到DNJ的標準曲線線性回歸方程為y= 15776x-70392，相關系數r=0.9996。式中x為DNJ濃度，μg/m L；y為峰面積。

按照1.2.3實驗方法，測定不同濃度蘆丁標準溶液的吸光度，得到蘆丁標準曲線線性回歸方程為y= 11.622x-0.0031，相關系數r=0.9997。式中，x為蘆丁濃度，μg/m L；y為吸光度。

按照1.2.4的實驗方法，測定不同濃度葡萄糖標準溶液的吸光度，得到葡萄糖的標準曲線線性回歸方程為y=10.909x-0.0021，相關系數r=0.9998。式中，x為葡糖糖的濃度，μg/m L；y為吸光度。

按照1.2.5的實驗方法，測定不同濃度沒食子酸標準溶液的吸光度，得到沒食子酸的標準曲線線性回歸方程為y=0.0208x+0.0034，相關系數r=0.9998。式中，x為沒食子酸的濃度，μg/m L；y為吸光度。

實驗結果表明，各標準曲線的相關系數均大于0.9990，線性關系良好，可用于樣品中相關活性成分的測定。

2.2 DNJ標準品和樣品的色譜圖

將DNJ經衍生化后上高效液相色譜儀進行測定，得到如圖1～圖3所示的色譜圖。

圖1 空白色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank sample

圖2 DNJ標準品色譜圖Fig.2 Chromatogram of DNJstandard

圖3 桑葉茶樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram ofmulberry-leaf tea sample

由色譜圖2可知，在本實驗條件下，DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留時間為2.731m in，與Gly-FMOC和FMOC-OH的峰間距分別相差2.719min和4.243min，表明這兩種物質均不干擾DNJ的測定。

2.3 不同菌種比例對發酵桑葉茶中DNJ含量影響

分別在不同比例下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+綠色木霉菌液10m L，在28℃發酵5h生產桑葉茶，探究其DNJ含量的變化。實驗結果如圖4所示。

由圖4可知，與自然發酵比較，所有菌種比例發酵后DNJ含量均增加，其中黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2發酵的桑葉茶中DNJ含量分別為147.8、151.3、148.4、145.7、142.5、 149.7mg/100g干重，比自然發酵分別增加了6.43%、8.94%、6.85%、4.93%、2.61%、7.82%，與自然發酵比較，以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶2發酵的桑葉茶中DNJ含量無顯著性差異（p＞0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2、1∶1∶1、1∶2∶2發酵后的桑葉茶中DNJ含量有顯著性差異（p＜0.05），特別是黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2發酵后的桑葉茶中DNJ含量最高達151.3mg/100g干重，這可能是黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2時更利于這3種菌種相互協同作用，利用桑葉茶中的營養物質從而產生DNJ。

圖4 不同發酵比例對發酵桑葉茶中DNJ含量影響Fig.4 The contentof DNJofmulberry-leaf tea by different fermentation strains rate

2.4 不同菌種比例對發酵桑葉茶中黃酮含量影響

分別在不同比例的下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+綠色木霉菌液10m L在28℃發酵5h生產桑葉茶，探究其黃酮含量的變化。實驗結果如圖5所示。

圖5 不同發酵比例對發酵桑葉茶中黃酮含量影響Fig.5 The contentof flavonoid ofmulberry-leaf tea by different fermentation strains rate

由圖5可知，與自然發酵比較，其中以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶2∶1時黃酮含量為4.22g/100g干重，增加了1.16%，無顯著性差異（p＞0.05）。以2∶1∶2、1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2比例發酵的桑葉茶中黃酮含量均降低，以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=1∶1∶2發酵的桑葉茶中黃酮含量為3.99g/100g干重，僅降低了4.24%，無顯著性差異（p＞0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2發酵桑葉茶中黃酮含量降低了8.98%，有顯著性差異（p＜0.05）；以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶2發酵的桑葉茶中黃酮含量分別為3.53、3.71、3.76g/100g干重，與自然發酵比較分別降低了15.39%、10.98%、9.73%，均具有極顯著差異（p＜0.01）。可能是由于黑曲霉、日本根霉、綠色木霉3種菌相互作用，當在黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶2∶1時利于桑葉茶中黃酮的產生，而其他5種比例時不利于黃酮的產生，反而要利用和分解桑葉茶中的黃酮，或有可能生成了其他有色物質。

2.5 不同菌種比例對發酵桑葉茶中多糖含量影響

分別在不同比例的下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+綠色木霉菌液10m L在28℃發酵5h生產桑葉茶，探究其多糖含量的變化。實驗結果如圖6所示。

圖6 不同發酵比例對發酵桑葉茶中多糖含量影響Fig.6 The contentof polysaccharid ofmulberry-leaf tea by different fermentation strains rate

由圖6可知，與自然發酵比較，其中以各比例的黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉發酵的桑葉茶中多糖含量均降低，其中以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=1∶2∶1發酵的桑葉茶中多糖含量為12.15g/100g干重，降低了6.78%，無顯著性差異（p＞0.05）；以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2發酵的桑葉茶中多糖含量分別為11.85、11.99、11.78g/100g干重，分別降低了9.12%、8.01%、9.64%，與自然發酵比較具有顯著性差異（p＜0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2、1∶2∶2發酵的桑葉茶中多糖含量分別為11.30、11.68g/100g干重，與自然發酵比較分別降低了13.30%、10.43%，具有極顯著差異（p＜0.01）。這可能是因為不同菌種比例的黑曲霉、日本根霉、綠色木霉相互作用后，分解利用了桑葉茶中的多糖，從而利于桑葉茶中其他活性成分的形成。

2.6 不同菌種比例對發酵桑葉茶中茶多酚含量影響

分別在不同比例的下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+綠色木霉菌液10m L在28℃發酵5h生產桑葉茶，探究其多酚含量的變化。實驗結果如圖7所示。

由圖7可知，與自然發酵比較，以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=1∶2∶1發酵的桑葉茶中多酚含量為0.66g/100g干重，多酚含量僅增加了1.68%，無顯著性差異（p＞0.05）；其余所有比例發酵的桑葉茶中多酚含量均降低，其中黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=2∶1∶2發酵的桑葉茶中多酚含量為0.61g/100g干重，多酚含量下降了6.26%，與自然發酵比較有顯著性差異（p＜0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2發酵的桑葉茶中多酚含量分別為0.54、0.58、0.57、0.49g/100g干重，與自然發酵比較分別下降了16.04%、9.76%、12.60%、23.90%，具有極顯著性差異（p＜0.01）。可能是發酵過程中黑曲霉、日本根霉、綠色木霉3種菌相互作用，當比例為1∶2∶1時利于桑葉茶中多酚的形成，而其他5種比例時桑葉茶中的大量多酚類化合物被氧化聚合成有色物質。

3 結論

通過上述研究結果的分析發現，黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=1∶2∶1發酵的桑葉茶中DNJ增加6.43%，黃酮增加1.16%，多糖降低6.78%，多酚增加1.68%，綜合品質好。而用黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=2∶1∶2發酵的桑葉茶中DNJ增加8.94%，為最高，其中DNJ是桑葉茶中最主要的功能性成分。因此，認為黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=2∶1∶2是在所用的實驗菌種比例中保證發酵桑葉茶功能性質最好的菌種。

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