野生仙人掌粗多糖脫蛋白方法的研究

朱 苗，袁清霞，程 杰，李 恒，李莉梅，張桂和，曾富華，*

（1.海南大學食品學院，海南海口570228；2.湛江師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江524048；3.廣東高校邊緣熱帶特色植物工程技術開發(fā)中心，廣東湛江524048）

我國仙人掌主要分布在廣西、廣東、江西、福建等省，資源豐富，發(fā)展?jié)摿薮?，開發(fā)和利用野生仙人掌符合當今人們自然、健康、綠色的消費需求，在國內(nèi)外市場都有廣闊的發(fā)展空間。20世紀早期常被用作牲畜飼料和造酒的原料，在民間也很早就作為治療潰瘍、抗炎、蛇咬傷等的藥物[1]。仙人掌粗多糖（Opuntia dillenii Haw.polysaccharides，ODPS）是仙人掌的主要活性成分之一，大量藥理學研究表明，其具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、提高免疫力和保肝護肝等生物活性[2-7]。

就文獻報道看來，仙人掌多糖的研究主要集中在提取工藝的優(yōu)化及其藥理作用的探討上，缺乏對其進行系統(tǒng)的、具體的結(jié)構(gòu)描述[8-10]。因此，我們需要尋找確實有效的分離純化方法，目前一般采用離子交換層析的方法進行純化，但游離蛋白的存在勢必會影響到離子交換層析的效果以及多糖得率，因此必須去除其中的游離蛋白。本文以野生仙人掌為原料，探討不同方法的蛋白脫除率、多糖和抗氧化性損失率，為其進一步分級純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

仙人掌 采自湛江東海島附近，經(jīng)湛江師范學院的陳燕副教授鑒定為Opuntia dillenii Haw.；考馬斯亮藍G-250和阿拉伯糖 FLUKA BioChemika公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH） 美國Sigma公司；硫酸、磷酸、95%乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉、氯仿、正丁醇、乙酸 分析純；水 為超純水。

Beekman 360型精密pH計 USA Beekman Coulter INC.；日立牌CR22E型高速冷凍離心機 Japan Hitachi Co.；4.5 Liter Freeze Dry System American Labconco Inc.；TU-1800S型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LABOROTA 4003-control型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Germany Heidolph Co.。

1.2 實驗方法

1.2.1 仙人掌粗多糖提取工藝 參照本實驗室Zhao等[11]的方法進行。新鮮仙人掌莖片除刺洗凈、切碎→80%食用酒精浸泡→干燥，粉碎過60目篩→熱水浸提→上清液→減壓濃縮→3倍體積95%乙醇醇沉→白色沉淀→凍干→粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 采用苯酚硫酸法[12]，以阿拉伯糖作標準品。標準曲線：y=0.0185x-0.0068，R2= 0.9991。線性范圍為7.5～37.5μg/m L。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍法[13]，以牛血清蛋白作標準品。標準曲線：y=0.0061x，R2= 0.9955。線性范圍為10～90μg/m L。

1.2.4 抗氧化性的測定 采用清除DPPH自由基的方法[14]。吸取樣品2.0m L于試管中，加入2.0m L 0.1mmol/L DPPH溶液，充分混勻，避光靜置30m in后，以50%乙醇調(diào)零，517nm波長測吸光值A樣品。同時，用50%乙醇代替DPPH溶液，測吸光值A對照；再用50%乙醇代替樣品，測吸光值A空白。

1.2.5 蛋白脫除率、多糖損失率及抗氧化性損失率的計算方法

1.2.6 仙人掌粗多糖的脫蛋白實驗

1.2.6.1 三氯乙酸（TCA）法 參照文獻[15]中的方法，取0.5%粗多糖溶液20m L分別加入等體積質(zhì)量濃度為3%、6%、9%、12%、15%三氯乙酸溶液，攪拌均勻，4℃靜置12h，8000r/min離心15min去沉淀，上清液用NaOH調(diào)pH至中性，定容。重復操作3次。分別測多糖、蛋白質(zhì)含量和抗氧化性。

1.2.6.2 Sevag法 參照文獻[16]中的方法，0.5%粗多糖溶液25m L與5m L Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1）混合，劇烈振蕩30m in，8000r/m in離心15m in，棄去中間沉淀和下層有機相，收集水相，定容。重復操作3次。測多糖、蛋白質(zhì)含量和抗氧化性。分別處理1、2、3、4、5、6、7次。

1.2.6.3 蛋白質(zhì)等電點法 參照文獻[17]中的方法，取20m L 0.5%粗多糖溶液，分別用乙酸調(diào)節(jié)pH至2.5、3.0、3.5、4.0和4.5，攪拌均勻，4℃靜置12h，8000r/m in離心15m in，上清液定容，重復操作3次。測多糖、蛋白質(zhì)含量和抗氧化性。

2 結(jié)果與分析

2.1 三氯乙酸（TCA）法

由圖1可知，三氯乙酸濃度較小時，蛋白脫除率較高，但隨著濃度的增加，蛋白脫除率逐漸降低并趨于穩(wěn)定，而多糖損失率相應減小，這是可能是由于三氯乙酸與蛋白質(zhì)結(jié)合生成的沉淀吸附了部分多糖導致的，而三氯乙酸并未將多糖降解為單糖。抗氧化性損失率隨濃度的增加呈大致上升趨勢，說明三氯乙酸濃度增加，對多糖降解越厲害，對其結(jié)構(gòu)破壞越強。三氯乙酸濃度過低，也不能有效的沉淀蛋白。當三氯乙酸濃度為3%時，蛋白脫除率為80.28%，多糖損失率為5.98%，抗氧化性損失率為34.56%，此時，脫蛋白效果最好。

圖1 三氯乙酸法脫蛋白對多糖質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of trichloroacetic acidmethod on the quality of the polysaccharide

2.2 Sevag法

由圖2可以看出，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白脫除率呈上升趨勢，但總的來說脫蛋白效果不是很好，進行7次脫蛋白處理，蛋白脫除率才達到58.30%。多糖損失率也隨之升高，達到了36.92%，這是因為每次脫蛋白處理都會造成一定的多糖損失。抗氧化性損失率基本上保持不變，但也較高。蛋白脫除率低于三氯乙酸法，抗氧化性損失率也略高于三氯乙酸法。由于Sevag法使用的試劑是氯仿和正丁醇，氯仿有毒，會造成多糖活性的下降，而且溶劑會有殘留，因此不宜用Sevag法脫蛋白。

圖2 Sevag法脫蛋白對多糖質(zhì)量的影響Fig.2 Effectof Sevagmethod on the quality of the polysaccharide

2.3 蛋白質(zhì)等電點法

由圖3可以看出，隨著糖液pH的升高，糖液中蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加然后降低，多糖損失率逐漸降低然后增加，抗氧化性損失率逐漸增加。用乙酸調(diào)節(jié)糖液pH為3.5時，蛋白質(zhì)脫除率最高，達60.86%，說明pH 3.5是仙人掌多糖中雜蛋白的等電點，此時多糖損失率達到最低，為1.67%，抗氧化性損失率為30.09%?？寡趸該p失低于Sevag法和三氯乙酸法，可能是由于其反應較溫和，對多糖結(jié)構(gòu)破壞較小。

2.4 3種方法中最佳脫蛋白方法的比較

由圖4可知，Sevag法脫蛋白多糖損失率最高，脫蛋白效果一般，抗氧化性損失率也略高于其他方法；三氯乙酸法和等電點法多糖損失率都較小，雖三氯乙酸法抗氧化性損失率略高于等電點法，但其脫蛋白效果卻遠高于等電點法。因此，可選擇三氯乙酸法脫蛋白。

圖3 蛋白質(zhì)等電點法對多糖質(zhì)量的影響Fig.3 Effectof the protein isoelectric pointmethod on the quality of the polysaccharide

圖4 三種脫蛋白方法效果的比較Fig.4 Effectof the comparison of three deproteinizationmethods

3 結(jié)論

實驗對比了三氯乙酸法、Sevag法和等電點法對仙人掌多糖脫蛋白的效果，其中，Sevag法需要重復多次操作，而且多糖損失較大，達到了36.92%；三氯乙酸法脫蛋白效率高，當濃度為3%時，蛋白脫除率為80.28%，多糖損失不明顯，只有5.98%，抗氧化性損失也不高；蛋白質(zhì)等電點法脫蛋白效果一般，最佳效果只達到60.86%，多糖損失較小，而抗氧化性損失最小。對比以上方法，采用3%的三氯乙酸進行脫蛋白。

[1]Bohm H.“Opuntia dillenii”-An interesting and promisingcactaceae taxon[J].JPACD，2008（10）：148-170.

[2]Yang N，Zhao M M，Zhu B H，et al.Anti-diabetic effects of polysaccharides from Opuntiamegacantha cladode in normal and streptozotocin-induced diabetic rats[J].Innovative Food Science &Emerging Technologies，2008（9）：570-574.

[3]Zhao L Y，Huang W，Yuan Q X，et al.Hypolipidemic effects and mechanisms of themain component of Opuntia dillenii Haw.polysaccharides in high-fat emulsion-induced hyperlipidemic rats[J].Food Chemistry，2012，134：964-971.

[4]梁蓓蓓，劉華鋼，曹俊濤.仙人掌果多糖對S180荷瘤小鼠抑瘤作用的實驗研究[J].癌癥，2008，27（6）：580-584.

[5]Huang X J，Li Q，Guo L J，et al.Protection of cactus polysaccharide against H2O2-induced damage in the rat cerebral cortex and hippocampus differences in time of administration[J].Neural Regen Res，2008，3（1）：14-18.

[6]Schepetkin IA，Xie G，Kirpotina L N，et al.Macrophage immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Opuntia polyacantha[J].International Immunopharmacology，2008，8（10）：1455-1466.

[7]喻寧華，曾富華，饒力群.仙人掌多糖對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國生化藥物雜志，2009，30（4）：255-258.

[8]袁清霞，趙龍巖，李子嬌，等.酸法提取仙人掌多糖工藝[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：42-45.

[9]趙龍巖，袁清霞，李子嬌，等.仙人掌多糖的雙酶法提取及含量測定方法優(yōu)化[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42（2）：96-100.

[10]梁艷，應苗苗，呂英華，等.微波輔助提取仙人掌多糖的工藝研究[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2006，22（7）：159-162.

[11]Zhao L Y，Lan Q J，Huang Z C，et al.Antidiabetic effect of a newly identified component of Opuntia dillenii polysaccharides [J].Phytomedicine，2011（18）：661-668.

[12]錢松祥，石森林，潘水珍.苯酚-硫酸法測定固元膠囊中多糖[J].中草藥，2006，37（8）：1180-1181.

[13]王文平，郭祀遠，李琳，等.考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質(zhì)的含量[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（l）：115-117.

[14]孟憲軍，劉曉晶，孫希云，等.藍莓多糖的抗氧化性與抑菌作用[J].食品科學，2010，31（17）：110-114.

[15]黃生權.赤靈芝多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)分析與生物活性研究[D].廣州：華南理工大學，2010.

[16]董英，張艷芳，孫艷輝.水飛薊粗多糖脫蛋白方法的比較[J].食品科學，2007，28（12）：82-84.

[17]李強，唐微，鄭偉，等.杜仲粗多糖脫蛋白方法的對比研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（3）：315-317.