微波輔助提取番石榴多酚的研究

鄺高波，黃 和

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

番石榴（Psidium guajava L.）屬于桃金娘科番石榴屬，為亞熱帶水果，在我國廣東、廣西、福建均有種植，味清香可口，果實(shí)中含有果肉86.5%，水分83.3%，各種營養(yǎng)成分每100g含有粗纖維3.8%～5.57%，粗蛋白0.76%～1.06%，粗脂肪0.36%～0.94%，除此之外，維生素和礦物質(zhì)含量也十分豐富[1]。番石榴中還含有黃酮、多酚、多糖等功能活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、止瀉等生理功能[2]，對心血管疾病等有預(yù)防作用。王琦等[3]對幾種臺灣水果的抗氧化能力和多酚含量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)番石榴中多酚含量和抗氧化活性均達(dá)到很高水平。Melo P S等[4]研究表明，番石榴中含有沒食子酸、槲皮素、兒茶素等多酚物質(zhì)。

植物多酚結(jié)構(gòu)復(fù)雜，性質(zhì)活潑，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同分為水解單寧和縮合單寧，分子量一般在500～3000u范圍內(nèi)。植物多酚具有抗氧化、清除自由基、抗病毒、抗腫瘤、抑菌消炎等作用[5]，近年來在食品和醫(yī)藥行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用。微波輔助提取是一種快速高效的提取生物活性物質(zhì)的方法，微波穿透力極強(qiáng)，可以滲透到基質(zhì)內(nèi)部引起極性物質(zhì)定向排列，產(chǎn)生高溫和高細(xì)胞內(nèi)壓使得細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)裂解釋放。它適合多種天然物質(zhì)的提取，和其他方法相比，主要優(yōu)點(diǎn)在于提取速度快、選擇性提取強(qiáng)、能耗低，設(shè)備簡單[6-7]。番石榴中多酚物質(zhì)的提取已有過些許研究[8-9]，但是將微波輔助提取技術(shù)用于番石榴果肉中多酚物質(zhì)的提取還未見報道。本實(shí)驗(yàn)對番石榴多酚的微波輔助提取工藝進(jìn)行探討，以微波功率、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取次數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，然后選取微波功率、提取時間和料液比三個因素對工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，為番石榴多酚的綜合利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番石榴 購于湛江沃爾瑪超市，產(chǎn)地湛江；沒食子酸對照品、鉬酸鈉、鎢酸鈉、硫酸鋰、無水碳酸鈉、無水乙醇、溴水、磷酸、鹽酸 均為國產(chǎn)分析純；果膠酶（≥30000U/g） 上海基免生物科技有限公司。

BL-620S電子天平、AUY-120電子分析天平日本Shimadzu公司；722S可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SIGMA3-18K高速冷凍離心機(jī) 北京博勵行儀器有限公司；HR2006攪拌機(jī) 珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司；EG720EAU-SS9（X）微波爐 佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微波輔助提取番石榴多酚 將新鮮的番石榴清洗后打漿，稱取適量于燒杯中，加入乙醇溶液，攪拌后置于微波爐中加熱，然后用紗布過濾收集提取液，提取液中加入適量果膠酶進(jìn)行酶解（37℃），冷凍離心后（8000r/m in，5m in）收集上清液。

1.2.2 Folin-ciocalteu法測定番石榴多酚含量

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照鄭仕宏[10]的方法對番石榴多酚含量測定的條件進(jìn)行了改良。稱量50g鎢酸鈉，12.5g鉬酸鈉于1L回流裝置中，加入350m L蒸餾水以及85%的磷酸25m L、濃鹽酸50m L，充分混勻后小火回流10h。再加入75g硫酸鋰，25m L蒸餾水及幾滴溴水，加熱至沸騰15m in，配制成福林酚試劑。降溫后定容至500m L，保存在冰箱中備用，使用時稀釋一倍。

準(zhǔn)確稱取0.05g沒食子酸，定容至1000m L，配制成50μg/m L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。常溫下分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4m L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液到10m L比色管，加入福林酚試劑2m L，搖勻后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的碳酸鈉溶液2.5m L，反應(yīng)30s后用蒸餾水定容至10m L，放置黑暗處反應(yīng)2h，765nm下測定吸光度，以沒加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)液為空白對照，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 多酚提取得率的計算 計算公式如下所示：

式中，C—樣品多酚濃度；V—多酚溶液的體積；m—番石榴漿質(zhì)量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對番石榴多酚提取得率的影響 稱取番石榴漿5g，在微波功率490W，料液比1∶10的條件下，分別用30%、40%、50%、60%、70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取70s，平行實(shí)驗(yàn)3次，測定總酚含量。

1.2.3.2 微波功率對番石榴多酚提取得率的影響 稱取5g番石榴漿，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶10的條件下，分別在70、210、350、490、630W的功率下提取70s，平行實(shí)驗(yàn)3次，測定總酚含量。

1.2.3.3 提取時間對番石榴多酚提取得率的影響 稱取5g番石榴漿，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶10，微波功率490W的條件下，分別提取10、40、70、100、130、160、190s，平行實(shí)驗(yàn)3次，測定總酚含量。

1.2.3.4 料液比對番石榴多酚提取得率的影響 稱取5g番石榴漿，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，微波功率490W的條件下，分別以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的料液比提取70s，平行實(shí)驗(yàn)3次，測定總酚含量。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取微波功率、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)作為實(shí)驗(yàn)因素，以番石榴多酚提取得率為響應(yīng)值，采用JMP軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計和分析，優(yōu)化提取工藝，響應(yīng)面的因素及水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table1 Independent variables and test design

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按1.2.2.1的方法制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。得到的回歸方程為y=0.1331x+0.0149，R2=0.9993，在1～7μg/m L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，適用于番石榴多酚總含量的測定。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對番石榴多酚提取得率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，番石榴多酚的得率呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時番石榴多酚得率最大，達(dá)到了1.56mg/g。根據(jù)相似相溶原理，這時番石榴多酚的極性可能與乙醇溶液的極性相當(dāng)，多酚類物質(zhì)易于從組織中釋放，因此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對番石榴多酚提取得率的影響Fig.2 Effectof ethanol concentration on extraction rate

2.3 微波功率對番石榴多酚提取得率的影響

圖3 微波功率對番石榴多酚提得取率的影響Fig.3 Effectofmicroware power on extraction rate

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，番石榴多酚提取得率隨著功率的升高而增加，在490W時達(dá)到1.74mg/g，超過490W后提取得率呈下降趨勢。功率過低，微波的穿透力不強(qiáng)，物料溫度偏低，分子運(yùn)動過慢，影響多酚物質(zhì)的提取。功率過高，可能導(dǎo)致多酚物質(zhì)被高溫破壞，得率較低，因此確定提取的微波功率為490W。

2.4 提取時間對番石榴多酚提取得率的影響

由圖4可知番石榴多酚提取得率隨提取時間的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在130s時提取得率達(dá)到最大值，為1.71mg/g。隨著時間的增加，溶液溫度升高，提取率增大，但過高的溫度會造成乙醇蒸發(fā)過快，多酚結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致得率下降，因此確定提取時間在130s。

圖4 提取時間對番石榴多酚提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

2.5 料液比對番石榴多酚提取得率的影響

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溶劑體積與質(zhì)量比值的增加，溶質(zhì)與溶劑接觸的表面積增大，番石榴多酚提取率逐漸增大，但是當(dāng)料液比低于1∶20后，提取得率變化不大，此時多酚物質(zhì)已基本完全浸出，再增加溶劑和物料的比例會造成原料的浪費(fèi)，因此確定料液比為1∶20為宜。

圖5 料液比對番石榴多酚提取得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2.6.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用JMP9軟件中Box-Behnken模型，選取微波功率（X1）、料液比（X2）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計，以番石榴多酚提取率為響應(yīng)值（Y），結(jié)果見表2。

2.6.2 響應(yīng)面模型分析 采用JMP9軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合分析，得到二次多項(xiàng)式方程：Y=1.8233333-0.0125X1+0.04X2+0.0075X3+0.0175X1X2+0.0425X1X3-0.0225X2X3-0.067917X-0.087917X-0.062917X，對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型p值為0.0003＜0.01，達(dá)到極顯著水平，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9883，R=0.9672，線性關(guān)系良好，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計合理可行。失擬項(xiàng)p值為0.656＞0.05為不顯著，失擬性良好，表明在實(shí)驗(yàn)條件下該方程模型可以預(yù)測番石榴多酚的提取得率。

表2 響應(yīng)面方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Design and results of central composition test

表3 方差分析表Table3 Table of variance analysis

根據(jù)F值大小可以得到各變量對番石榴多酚提取率的影響順序?yàn)椋毫弦罕龋╔2）＞微波功率（X1）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）。其中料液比對多酚提取率影響極顯著（p=0.0004），微波功率對多酚提取率的影響為顯著水平（p=0.0476），乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取率影響不顯著。二項(xiàng)式X、X、X的p值都達(dá)到極顯著水平，X1X2項(xiàng)p值為0.0491，表明料液比和微波功率的交互作用對番石榴多酚的提取影響顯著。X2X3項(xiàng)的p值為0.0209，表明料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對番石榴多酚的提取也是有顯著影響，X1X3項(xiàng)p值為0.0015，表明微波功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對番石榴多酚提取影響達(dá)到極顯著水平。

2.6.3 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)面圖可以直觀的看出因素之間的交互作用對多酚提取率的影響，將某個單因素固定在零水平，即可得到其他兩個因素的響應(yīng)面圖（見圖6～圖8）。

圖6顯示了在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、時間為130s時，微波功率和料液比之間的交互作用對番石榴多酚提取得率影響的響應(yīng)面圖。從圖中可知，當(dāng)微波功率一定時，多酚提取得率隨著料液比（m∶v）的降低而增加。當(dāng)料液比一定時，提取得率隨著功率增加先增大后降低，但是變化較不明顯。微波功率和料液比之間的交互作用圖存在頂點(diǎn)，等高線呈橢圓形，在微波功率490～560W，料液比1∶19～1∶23范圍內(nèi)響應(yīng)值較大，對多酚提取得率影響顯著。

圖6 微波功率和料液比對番石榴多酚提取得率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface showing the interactive effects of microware power and solid-liquid ratio on the polyphenols yield of guava

圖7 微波功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對番石榴多酚提取得率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface showing the interactive effects of microware power and ethanol concentration on the polyphenols yield of guava

圖7是在料液比1∶20、提取時間130s條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率交互作用圖。由圖7可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時，番石榴多酚提取得率隨微波功率的增加而緩慢增大，在超過560W后，多酚提取得率快速下降。微波功率一定時，多酚提取得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，響應(yīng)值在功率420～560W，乙醇體積分?jǐn)?shù)45%～55%范圍內(nèi)最大，交互作用極顯著。

圖8描述了在微波功率490W、提取時間130s條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比之間對番石榴多酚提取得率的交互作用。多酚提取得率在料液比達(dá)到1∶19之前增加趨勢明顯，然后緩慢升高。在乙醇濃度40%～50%范圍內(nèi)，多酚提取得率隨著乙醇濃度的升高而增加，當(dāng)乙醇濃度超過50%以后多酚提取得率緩慢下降。等高線為橢圓形，交互作用顯著，在乙醇濃度50%～55%，料液比1∶21～1∶23范圍內(nèi)響應(yīng)值最大。

圖8 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對番石榴多酚提取得率的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface showing the interactive effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration on the polyphenols yield of guava

2.6.4 最佳工藝和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由JMP9軟件分析得到微波輔助提取番石榴多酚的最佳工藝為微波功率483.21W，料液比1∶21.12（m∶v），乙醇濃度49.98%，提取時間130s，在此條件下番石榴多酚理論提取率可達(dá)到1.83mg/g。由于實(shí)際條件限制，適當(dāng)調(diào)整為微波功率490W，料液比1∶21，乙醇濃度50%，提取時間130s。此時的理論提取率為1.82mg/g，經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際提取率為（1.78±0.38）mg/g，相對誤差為2.19%，說明該模型能準(zhǔn)確的應(yīng)用于番石榴多酚的微波輔助提取工藝。

3 結(jié)論

微波輔助提取能有效的提取番石榴多酚，具有時間短、耗能少、效率高等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)探索的最佳的提取工藝為功率490W，料液比1∶21，乙醇濃度50%，提取時間130s，提取率為（1.78±0.38）mg/g，此工藝條件可以為番石榴多酚的進(jìn)一步研究和綜合利用提供技術(shù)參考。

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