響應面法優化棗核總黃酮超聲提取工藝研究

陳 蘭，李喜宏，王騰月，郝梅梅，馬 文

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

我國大棗資源豐富，年產量可達300多萬t，其營養價值和藥用價值極高，被譽為“木本糧食，滋補佳品”。目前，大棗產品多種多樣，如蜜棗、棗泥、棗脯、棗酒等，而其加工和食用后的棗核下腳料則被丟棄或燒掉。《本草綱目》中記載：“核，燒、研，慘脛瘡良”，可見，棗核具有一定的藥用價值，若被丟棄或燃燒，在一定程度上污染了環境，并造成資源的浪費。研究表明，棗核中有較多的總黃酮物質，并且具有預防心腦血管疾病、防癌抗癌的功效[1-2]。以棗核為材料，提取其中的總黃酮物質，可以為棗核的綜合利用提供理論依據。黃酮類物質的主要提取方法有機溶劑提取法、堿性稀醇或堿性水提取、超濾法、超聲波輔助提取法、微波提取法和酶輔助提取法[3-4]，其中超聲波輔助提取具有提取率高、提取時間短等特點，被廣泛應用于生物活性物質的提取。與正交和均勻設計相比，Box-Behnken設計可以評價指標和因素間的非線性關系，使用方便，條件預測性好，對實驗影響因素的研究較為全面[5-6]。經查閱，采用超聲波提取法對棗核中總黃酮進行提取的相關研究較少[7-8]，本文將以棗核為實驗材料，結合單因素實驗和響應面實驗設計對棗核中總黃酮的超聲提取工藝進行優化，旨在獲取最佳工藝參數，為棗核的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棗核 烘干后粉碎過40目篩（寧夏靈武地區靈武長棗）；蘆丁標品 中國藥品生物制品檢定所。

UV-2550PC型紫外可見分光光度計日本島津公司；FW-100型高速萬能粉碎機 北京市永光明醫療儀器廠；Scientz-ⅡD型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮標準曲線的繪制 本實驗以蘆丁為標品，采用NaNO2-A l（NO3）3比色法測定標準曲線[9-10]。蘆丁標品濃度C（mg/L）在一定范圍內與吸光度A呈良好的線性關系。線性回歸方程為A=10.866C+0.0025，線性回歸系數R=0.9991。

1.2.2 棗核中總黃酮的超聲提取工藝及單因素實驗

準確稱取一定量的干燥棗核粉，用50%的乙醇作為浸提劑，在設定的料液比（1∶40）、超聲功率（300W）、提取溫度（55℃）下超聲提取60min，抽濾得澄清溶液即為粗黃酮提取液。在進行單因素實驗時，分別固定料液比（1∶40）、超聲功率（300W）、提取溫度（55℃）中的兩個因素，分別考察第三個因素料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）、超聲功率（200、250、300、350、400、450W）、提取溫度（25、35、45、55、65、75℃）對棗核中總黃酮提取率的影響，進行單因素實驗。

1.2.3 棗核中總黃酮提取率的計算 準確量取一定體積的總黃酮提取液，按1.2.1中的相關步驟，測吸光度，將數據代入線性回歸方程得濾液中總黃酮濃度，再按下式計算得棗核中總黃酮提取率：Y（mg/g）= C×V/M

式中，C為提取液中總黃酮濃度，mg/L；V為抽濾后得的濾液總體積，L；M為稱取的棗核粉質量，g。

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，以棗核中總黃酮提取率為響應值，根據Box-Behnken實驗設計原理[11]，運用Design Expert 8.0軟件設計三因素三水平響應面實驗，考察料液比、超聲功率、提取溫度及因素間交互作用對棗核中總黃酮提取率的影響，因素水平設計見表1。

表1 響應面分析因素水平表Table1 Factors and levels of response surfacemethodology

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

圖1 料液比對棗核中總黃酮得率的影響Fig.1 Effectof solid-liquid ratio on extraction of total flavonoids from date seeds

2.1.1 料液比對棗核總黃酮提取率的影響 圖1為料液比對總黃酮提取率的影響，由圖1可以看出，當料液比在1∶20～1∶50之間時，黃酮提取率隨料液比增加而增加，當料液比在1∶50～1∶70時，提取率有緩慢下降的趨勢，這是因為料液比大時，浸提劑乙醇可以與棗核粉充分接觸，使黃酮類物質容易溶出，但是當其超過一定范圍時，會導致其他雜質的過多溶出，從而影響總黃酮的溶解，并且為后續抽濾分離帶來負擔，增加成本。

2.1.2 超聲功率對棗核總黃酮提取率的影響 實驗結果如圖2所示。由圖2可知，當超聲功率小于300W時，總黃酮得率隨著超聲功率的增加而迅速提高，當超聲功率達到300W時，總黃酮得率達到最大值5.78mg/g，功率繼續增大時，提取率反而下降，這是因為超聲波可以使植物細胞壁形成較多的小孔，增強細胞膜的透性，利于胞內物質的溶出，但是功率過大會對黃酮類物質造成破壞，并且會增加能耗，增加提取成本。

圖2 超聲功率對棗核中總黃酮得率的影響Fig.2 Effectof ultrasonic power on extraction of total flavonoids from date seeds

2.1.3 提取溫度對棗核總黃酮提取率的影響 實驗結果如圖3所示。由圖3可知，當溫度小于55℃時，隨著溫度的增高，棗核中總黃酮得率也隨之增加，但是當提取溫度超過55℃時，總黃酮得率開始下降，這是因為適當提高溫度可以增強超聲波對細胞的破壞作用，并加快總黃酮的滲透和擴散速度[12]，但是溫度過高時，黃酮物質發生降解，并且長時間加熱，導致浸提劑乙醇揮發，影響黃酮的浸出，因此確定提取溫度在55℃左右比較合適。

圖3 提取溫度對棗核中總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of total flavonoids from date seeds

2.2 響應面優化總黃酮提取工藝的結果

2.2.1 回歸模型的建立與分析 在單因素實驗的基礎上，進行三因素三水平響應面設計分析，設計17次實驗，其中析因實驗12次，中心組合實驗重復5次，實驗設計方案及結果如表2所示，方差分析見表3。

表2 響應面設計方案及實驗結果Table2 Design and results of response surfacemethodology

利用Design Expert 8.0軟件對表2中的數據進行多元回歸擬合分析，得到響應回歸方程：

式中，Y為棗核中總黃酮含量的預測值，A、B、C分別為料液比、超聲功率、提取溫度。

由表3的方差分析可知，該模型高度顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著（p=0.6809＞0.05），決定系數R2=0.9895，校正系數R=0.9760，表明此模型對于棗核中總黃酮得率實際值與預測值之間具有很好的擬合度，可用該模型對棗核中總黃酮得率進行很好地分析和預測。

由表3還可看出，所選3個因素及之間的交互作用對總黃酮得率有顯著影響，其中超聲功率B和提取溫度C分別對總黃酮提取率有極顯著的影響，料液比和提取溫度之間的交互作用極顯著，且由p值和F值可以看出，各因素對總黃酮提取率影響的順序為：提取溫度＞超聲功率＞料液比。

圖4 超聲功率和料液比交互作用的響應面Fig.4 Response surface of ultrasonic power and solid-liquid ratio

表3 回歸方差分析表Table3 Variance analysis ofmathematical regressionmodel

2.2.2 響應面分析 響應曲面三維圖可以直觀的反映各因素對響應值的影響程度及因素間的交互作用強弱，三維圖在平面上的投影即為等高線圖，等高線形狀反映了交互影響的強弱，等高線趨于圓形時，兩因素的交互作用相對較弱；等高線為橢圓形時，兩因素的交互作用相對較強[13]，回歸模型的響應面分析所作的響應曲面圖如圖4～圖6所示。從圖4～圖6可以看出，所選三個因素的主效應顯著，并且因素之間的交互作用也較大，與方差分析的結果相吻合；從三組三維曲面圖可以看出提取溫度溫度相較于超聲功率、料液比的曲線較陡峭，說明溫度對于總黃酮提取的影響最為顯著；當提取溫度固定時，超聲功率的曲線比料液比的陡峭，再一次的驗證了棗核總黃酮的提取過程中，超聲功率的影響比料液比的大。由圖4可以看出，三維圖的投影等高線圖呈橢圓形，并且橢圓的軸線與縱、橫坐標存在著一定的角度，說明料液比和提取溫度存在著極顯著的交互作用，這與回歸方差分析表的結果相吻合。

圖5 提取溫度和料液比交互作用的響應面Fig.5 Response surface of extraction temperature and solid-liquid ratio

圖6 提取溫度和超聲功率的響應面Fig.6 Response surface of extraction temperature and ultrasonic power

2.2.3 最佳工藝的預測與驗證 利用D esign-expert 8.0的optim ization功能，將總黃酮提取率的Goal選項選擇為m aximize，可得到唯一一個優化方案，即：料液比1∶49.57、超聲功率為305.59W、提取溫度為58.15℃，棗核中總黃酮得率預測值為7.06mg/g。考慮實際操作過程的方便性，選擇提取工藝參數為：料液比1∶50、超聲功率305W、提取溫度60℃，在該工藝下進行五次平行實驗所得的總黃酮平均得率為7.03mg/g，與預測值之間的相對誤差僅為0.43%，表明用響應面法對棗核中總黃酮超聲提取的各因素進行優化研究是合理可行的，可以為工業化的生產提供合理的方案。

3 結論

采用超聲法提取棗核中的總黃酮，通過單因素實驗和響應曲面分析優化工藝條件，并結合實際操作確定棗核中總黃酮超聲提取的最佳工藝為：料液比1∶50、超聲功率305W、提取溫度60℃，提取率為7.03mg/g，提取率較高，對棗核中總黃酮進行提取利用是工業下腳料棗核資源化的有效途徑，可為棗核的再利用提供參考依據。

[1]張志國.冬棗核類黃酮的提取工藝研究及其生物功能初探[D].西安：陜西師范大學，2006.

[2]張娜，楊保求，王倩，等.棗核黃酮類物質的抗氧化性研究[J].安徽農業科學，2010，35：20037-20039.

[3]梁單，張保存.黃酮類化合物提取和分離方法研究進展[J].周口師范學院學報，2007，24（5）：87-88.

[4]李巧玲.黃酮類化合物提取分離工藝的研究進展[J].山西食品工業，2003（4）：6-7.

[5]高曉娟，馬志剛，董琳，等.響應面法優化伏毛鐵棒錘根部總生物堿提取工藝[J].中藥材，2010（10）：1628-1632.

[6]Yan Y，Yu C，Chen J，et al.Ultrasonic-assisted extraction optimized by response surfacemethodology，chemical composition and antioxidant activity of polysaccharides from Tremella mesenterica[J].Carbohydrate Polymers，2011，83（1）：217-224.

[7]張春蘭，張銳利，熊素英，等.超聲波輔助提取紅棗核中總黃酮的研究[J].安徽農業科學，2010（12）：6503-6505.

[8]張吉祥，歐來良.正交實驗法優化棗核黃酮的超聲提取工藝研究[J].食品工業科技，2012（10）：280-283.

[9]張進棠，姚本林，劉伏煌，等.銀杏葉提取物中總黃酮的紫外分光光度測定[J].武漢化工學院學報，1998（1）：27-29.

[10]郭雪峰，岳永德.黃酮類化合物的提取·分離純化和含量測定方法的研究進展[J].安徽農業科學，2007（26）：8083-8086.

[11]Yamazaki，Kushida N，Oguchi A，et al.Response Surface Design and Analyses[M].New York：Marcel Dekker Inc，1987：149-205.

[12]陳志偉，陳坤，胡銀川，等.響應面法對苦丁茶總黃酮提取工藝的優化[J].西南大學學報：自然科學版，2012（5）：119-125.

[13]王梅英，陳慧斌，陳軍.響應面法優化超聲波輔助提取巖茶總黃酮工藝研究究 [J].食品工業科技，2011，32（12）：327-330.