高產M onacolin K紅曲霉菌種的誘變選育及液態發酵工藝優化

胡文效，魏彥鋒，蔣錫龍，史紅梅，李彥奎，劉一凡

（山東省葡萄研究院，山東濟南250100）

我國利用紅曲霉的歷史悠久，主要是在釀酒中的應用以及利用其紅色素對食品著色[1]。1979年日本學者Endo A等[2]發現紅曲霉次級代謝產物Monacolin K及其類似物具有羥甲基戊二醛輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑的作用。目前Monacolin K已成為各國公認的最佳血脂調節物[3-4]，對產Monacolin K紅曲霉菌株的選育成為熱點，唐偉等[5]對產Monacolin K紅曲霉菌株進行了亞硝酸和UV復合誘變，選育出產Monacolin K含量達到18.7mg/L的紅曲霉菌株，吳學倩等[6]通過紅曲霉原生質體誘變和融合，選育出一株高產Monacolin K菌株，其固體發酵含量可達3328.6μg/g。

桔霉素是一種真菌毒素，1995年法國學者Blanc在紅曲霉的發酵物中檢測出桔霉素[7]，其具有腎毒性、致癌性、致突變等作用[8]。桔霉素副作用的存在嚴重制約了紅曲酶的應用[9]，之前的研究只注重Monacolin K的含量，對桔霉素的關注不多。優良菌株是生產高品質、高產量Monacolin K的基礎和關鍵[5]，誘變篩選是獲得優良紅曲霉菌株的有效途徑。目前我國紅曲霉液態發酵生產Monacolin K的報道和研究不是很多，原因在于液態發酵產量低。但液態發酵也具有自身優點，其規模大且生產過程便于自動化控制，勢必將節省生產成本。本研究通過三次誘變，以期篩選出高產Monacolin K且低桔霉素的菌株，并對其液態發酵條件進行研究和探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米 市售；出發菌株 實驗室分離及購買的紅曲霉菌株29株，編號M 1～M 29，紅曲霉培養后測定Monacolin K的含量及桔霉素含量，確定以M 2為誘變出發菌株；Monacolin K標準品、桔霉素標準品 Sigma公司；瓊脂、葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸二氫鉀 國藥集團，分析純；酵母膏葡萄糖瓊脂培養基 酵母膏8g，葡萄糖100g，瓊脂15g，蒸餾水1000m L，pH自然，121℃滅菌30m in，用于菌種活化；大米培養基 將大米于30℃水中浸泡2h，瀝干，分裝于500m L三角瓶（100g/瓶）瓶）中，121℃滅菌20m in，趁熱打散，冷卻備用；限量培養基 葡萄糖1.0g，硫酸銨0.5g，蒸餾水1000m L，pH自然，121℃滅菌30m in，用于紅曲霉孢子萌動；液體培養基 葡萄糖60g，蛋白胨25g，酵母膏5g，硫酸銨5g，磷酸二氫鉀0.25g，蒸餾水補足1000m L，pH 6.0，121℃滅菌30m in，用于紅曲霉產Monacolin K的液態培養。

YXQG02型手提式電熱壓力蒸汽消毒器 山東新華安得醫療用品有限公司；SW-CJ-ZD型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；GSP-9160MBE型隔水式恒溫靜置培養箱 上海博迅實業有限公司；HZQQ型全溫振蕩器 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；Sigma 3-30K型實驗室高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Infinity 1260型HPLC儀 安捷倫科技有限公司；BILONG2-IIDL型超聲波細胞粉碎機 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Monacolin K的HPLC檢測條件 Monacolin K檢測的色譜條件參考文獻[9]。

檢測波長：紫外吸收光譜掃描結果顯示Monacolin K在231、238、246nm處有三個特征吸收峰，238nm處吸收值最大，231nm次之。因此HPLC檢測時，選238、231nm為吸收峰，其中定性測定時參考238、231nm的圖譜，定量測定參考238nm條件下的圖譜。

色譜條件：色譜柱C18（5μm，150mm×4.6mm），流動相乙腈：0.1%磷酸（V/V）65∶35，柱溫25℃，流速1m L/m in。在以上條件下Monacolin K達到基線分離。稱取Monacolin K標準品21.5mg，用無水乙醇溶液溶解定容至100m L容量瓶。精確稱取8、6、2、0.5m L、0.2m L定容至10m L，混合均勻。10μL進樣測定。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 桔霉素的檢測條件 桔霉素檢測色譜條件參考文獻[10]。色譜柱：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-磷酸水溶液（5.0m L/L）=72-28；流速：1.0m L/m in；熒光檢測器，激發波長：331nm；發射波長：500nm。將桔霉素標樣質量濃度分別稀釋為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0μg/m L。以峰面積為縱坐標，桔霉素濃度為橫坐標做標準曲線。

1.2.3 Monacolin K提取方法 發酵產物的處理：固體紅曲米研磨至20目，液態產物離心棄上清，沉淀物50～60℃烘干，研磨至20目。

提取方法：70%乙醇為提取溶劑，500W超聲波細胞破碎15m in，料液比為1∶6。

1.2.4 誘變處理

1.2.4.1 出發菌株孢子懸浮液制備 斜面種子用含0.9%NaCl無菌水洗滌紅曲孢子，制備孢子懸浮液[11-12]，通過鏡檢將孢子懸浮液稀釋至104～105之間。

1.2.4.2 UV誘變 取0.1m L孢子懸液，涂布于PDA平板，UV 0.3m處照射，設置對照和時間梯度。照射后30℃暗培養7～8d，計算致死率，選擇合適處理時間進行誘變選育。

1.2.4.3 LiCl誘變 配制0.2‰～1.6‰LiCl溶液，吸取0.2m L，涂布平板，完全吸收后，取孢子懸液0.1m L涂布，30℃培養7d，計算致死率，選擇合適的處理劑量進行誘變選育。

1.2.4.4 硫酸二乙酯+氯化鋰復合誘變 將孢子懸液用硫酸二乙酯（1%）處理30～70m in，28℃，置于搖床，150r/min，每10min取樣，測得硫酸二乙酯（1%）的致死率，選擇合適的處理時間與氯化鋰進行復合誘變選育。

1.2.5 發酵條件的單因素實驗

1.2.5.1 碳源與氮源的選擇 以液體培養基為基礎，測定碳源（含量7%）（甘油、葡萄糖、乳糖、大米粉、玉米粉、大米粉水解液、玉米粉水解液），氮源（含量0.5%）（酵母膏、牛肉膏、硝酸鈉、蛋白胨、硫酸銨）對Monacolin K含量的影響。5%接種量，30℃，150r/m in培養12d，測定Monacolin K含量。

1.2.5.2 土豆汁或豆芽汁對Monacolin K含量的影響

培養基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，土豆汁或豆芽汁補足1000m L，pH 6.0。5%接種量，30℃，150r/m in培養12d，測定Monacolin K含量。

1.2.5.3 鎂離子、鋅離子對Monacolin K含量的影響培養基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，豆芽汁補足1000m L，pH6.0，MgSO（40.1%、0.5%）和ZnSO4（0.2%、0.3%）分別加入。5%接種量，30℃，150r/m in培養12d，測定Monacolin K含量。

1.2.5.4 接種量對Monacolin K含量的影響 培養基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，豆芽汁補足1000m L，pH 6.0。不同接種量（3%、4%、5%、6%、7%、8%）接入種子液，培養條件：30℃，150r/m in培養12d，測定Monacolin K含量。

1.2.5.5 搖床轉速對Monacolin K含量的影響 培養基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，豆芽汁補足1000m L，pH 6.0。接種量5%，30℃，搖床轉速（r/m in）分別為100、120、140、160、180、200，培養12d，測定Monacolin K含量。

1.2.5.6 發酵液中甘油含量對Monacolin K含量的影響 培養基：碳源甘油含量分別為6%、7%、8%、9%、10%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，MgSO40.1%，ZnSO40.2%，5%接種量，豆芽汁補足1000m L，pH6.0。30℃，150r/m in培養12d，測定Monacolin K含量。1.2.5.7 發酵液中蛋白胨含量對Monacolin K含量的影響 培養基：甘油7%，大米粉水解液2%，MgSO40.1%，ZnSO40.2%，蛋白胨含量梯度分，別為0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.5%，豆芽汁補足1000m L，pH6.0。5%接種量，30℃，150r/m in培養12d，測定Monacolin K含量。

1.2.5.8 發酵溫度對Monacolin K含量的影響 培養基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，MgSO40.1%，ZnSO40.2%，豆芽汁補足1000m L，pH 6.0。接種5%，發酵溫度分別為26、28、30、32℃，150r/m in培養12d，測定Monacolin K含量。

1.2.5.9 起始pH對Monacolin K含量的影響 培養基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，MgSO40.1%，ZnSO40.2%，豆芽汁補足1000m L，用6%HCl和2.0mol/L的NaOH調節液體培養基的pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0。5%接種量，30℃，150r/m in培養12d，測定Monacolin K含量。

1.2.6 發酵條件的正交實驗優化 選取甘油含量、蛋白胨含量、發酵溫度及液體培養基起始pH四個因素進行4水平的正交實驗，正交實驗因素與水平見表1。

表1 紅曲霉培養條件正交因素與水平表Table1 Experimentassignmentof the level and factor of Monascus culture conditions

1.2.7 驗證實驗及最佳發酵時間的確定 根據單因素及正交實驗的結果，在最優培養基和最優發酵條件下對篩選菌株進行發酵實驗，發酵14d，每天測定Monacolin K含量。

2 結果與分析

2.1 HPLC法測定Monacolin K和桔霉素的標準曲線

Monacolin K標準曲線圖見圖1，其回歸方程為y= 403.63x+5.4176，R2=0.9998，相關性良好，線性范圍為：0.0043～0.172mg/m L。

圖1 HPLC法測定Monacolin K含量標準曲線Fig.1 Standard curve of Monacolin K contentmeasured by HPLC

桔霉素標準曲線圖見圖2，其回歸方程為y= 1463438x+69412，R2=0.9998，相關性良好，線性范圍為：0.25～5μg/m L。

圖2 HPLC測定桔霉素含量標準曲線圖Fig.2 Standard curve of citrinin contentmeasured by HPLC

2.2 菌種的誘變

2.2.1 誘變劑的確定 由表2可知，UV處理5m in、 1.2‰氯化鋰誘變以及1%硫酸二乙酯處理60m in時的致死率分別為97.1%、98.7%和98.1%。

表2 誘變劑的確定Table2 The determination ofmutagen

2.2.2 UV誘變菌株的篩選 UV誘變處理后，獲得48株變異菌株，編號：Mu-1～Mu-48。5株菌株Monacolin K產率提高且桔霉素含量較低（見表3），其中Mu-29菌株Monacolin K產量最高且桔霉素的量最低，故選擇其為氯化鋰誘變的出發菌株。

表3 UV處理突變株的Monacolin K和桔霉素含量Table3 Contents of Monacolin K and citrinin in mutant strainsmutagenized by UV

2.2.3 氯化鋰誘變菌株的篩選 氯化鋰誘變后，獲得變異菌株35株，編號：ML-1～ML-35，其中5株Monacolin K產率提高明顯，且桔霉素含量較低（見表4），菌株ML-21的Monacolin K產量最高，達0.957mg/g，故以ML-21為出發菌株進行硫酸二乙酯誘變。

表4 氯化鋰突變株的Monacolin K和桔霉素含量Table4 Contents ofMonacolin K and citrinin in mutant strainsmutagenized by LiCl

表5 復合誘變菌株的Monaco1in K和桔霉素含量Table5 Contents ofMonacolin K and citrinin in mutant strainsmutagenized by LiCl and diethyl sulfate

2.2.4 硫酸二乙酯+氯化鋰復合誘變菌株的篩選 獲得3株突變株，其Monacolin K的含量提高明顯且桔霉素含量較低，其中MS-12產率提高最大（見表5），故選擇其為選育的目的菌株。

表6 碳源對紅曲霉產Monacolin K的影響Table6 Effectof carbon sources on Monacolin K contentof Monascus

2.3 發酵條件優化

2.3.1 液態發酵最佳碳源的確定 碳源是微生物生長代謝最重要的營養物質之一，它是構成菌體和代謝物、為菌體生命活動提供能量的最重要的物質。7種單一碳源實驗的結果見表6，甘油是最有利于提高Monacolin K產量的單一碳源，產量為86.1μg/m L，大米水解液次之為56.2μg/m L。根據單一碳源的實驗結果選擇3種復合碳源，其他條件不變進行發酵實驗，其中甘油7%+大米粉水解液2%作為復合碳源，Monacolin K的產量達到124.2μg/m L（見表6）。可能是甘油+大米粉水解液更有利于紅曲霉MS-12菌株的生長和次生代謝產物的生成，故選擇其為紅曲霉發酵的碳源。

2.3.2 液態發酵最佳氮源的確定 氮源是構成菌體細胞中核酸、蛋白質和細胞質的主要成分，也是合成各種含氮代謝產物的重要原料。由表7可知，蛋白胨為氮源時的產量最高為123.4μg/m L，其次是酵母膏和牛肉膏。無機氮源硝酸鈉和硫酸銨目標產物的產量都比較低，可能是有機氮為遲效氮源，這種利用方式不易產生某些代謝產物的過分積累而阻礙目的物質的產生，即代謝產物的阻遏作用。因此確定蛋白胨為最佳的氮源。

表7 氮源對紅曲霉產Monacolin K的影響Table7 Effects of nitrogen sources on Monacolin K contentof Monascus

表8 添加土豆汁或豆芽汁對紅曲霉產Monacolin K的影響Table8 Effectofmurphy juice and bean sprouts juice on Monacolin K contentof Monascus

2.3.3 土豆汁或豆芽汁對紅曲霉菌株MS-12產Monacolin K的影響 分別以蒸餾水、土豆汁和豆芽汁配制的液體培養基發酵MS-12其Monacolin K產量見表8，土豆汁和豆芽汁都可不同程度地提高目標產物的產量，特別是豆芽汁中含有的豐富的氨基酸和維生素等物質，能夠更好地促進Monacolin K的產生。其中采用豆芽汁目標產物產量提高較大，產量達到142.1μg/m L，故選擇豆芽汁配制紅曲霉液體發酵培養基。

2.3.4 MgSO4和ZnSO4對紅曲霉M 2菌株產Monacolin K的影響 鎂離子是許多酶的激活劑，鋅是乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶的輔基。它們的存在可能會在微生物的代謝過程中起著特殊的作用，對菌體的生長和次生代謝產物產生有一定的作用。由表9可以看出，添加MgSO4和ZnSO4對Monacolin K的產量都有提高，其中0.1%MgSO4和0.2%ZnSO4對Monacolin K的產量提高較大，確定該濃度為兩種硫酸鹽的添加濃度。

2.3.5 不同接種量對Monacolin K產量的影響 由圖3可知，接種量為6%時目標產物的產量最高為137.9μg/m L。接種量低時，Monacolin K積累較少，可能由于培養基營養成分相對豐富，有利于菌體的生長而不利于Monacolin K的積累。較大的接種量可縮短生長達到高峰的時間，使產物的合成提前，且種子液多時其胞外水解酶類含量也多，利于基質的利用及Monacolin K的產生和積累。而接種量過大，菌種生長過快，對發酵后期次級代謝產物Monacolin K積累有一定的阻遏作用，其Monacolin K的生成量也相對較低。故最佳接種量為6%。

圖3 接種量對紅曲霉產Monacolin K的影響Fig.3 Effectof inoculum size on Monacolin K content of Monascus

表9 MgS04和ZnSO4對紅曲霉產Monacolin K的影響Table9 EffectofMgSO4 and ZnSO4 on Monacolin K contentof Monascus

2.3.6 發酵搖瓶轉速對Monacolin K產量的影響 紅曲霉是一種好氣性微生物，發酵過程中需向發酵培養基中不斷通入凈化過濾后的空氣，保證發酵液中溶氧的含量，并使溶解氧分布均勻是菌體生長繁殖的重要條件。從圖4可知，并非轉速越大，Monacolin K的產量越高，轉速為140～160r/m in時，Monaco1in K的產量較大。轉速過大，雖能增加溶解氧含量，提供紅曲霉足夠的營養成分。但因機械損傷加大或菌體呈現團塊狀生長而影響其菌體的自由蔓延，從而導致生長的生物量降低。故最佳轉速為150r/min。

圖4 轉速對紅曲霉產Monacolin K的影響Fig.4 Effectof the rotate speed on Monacolin K content of Monascus

2.4 紅曲霉液態發酵單因素實驗

2.4.1 發酵液中甘油含量對Monacolin K含量的影響

液體發酵培養基中甘油含量對Monacolin K含量的影響見圖5，蛋白胨含量增加，產物的含量隨之增加，但當甘油含量10%時，產物含量降低，可能因為碳氮比過高，菌體代謝不平衡，造成產物積累下降。

圖5 甘油含量對紅曲霉產Monacolin K的影響Fig.5 Effectof glycerol contenton Monacolin K content of Monascus

2.4.2 發酵液中蛋白胨含量對Monacolin K含量的影響 液體發酵培養基中蛋白胨含量對Monacolin K含量的影響見圖6，隨著蛋白胨含量的增加，Monacolin K產量增加，但蛋白胨含量大于1%時，蛋白胨含量增加，產物的含量在減少。這是因為對微生物培養時，碳氮比過高過低都不利于微生物的生長，碳氮過低菌體提前自溶，碳氮比過高菌體代謝不平衡，不利于代謝產物的積累。故蛋白胨含量1%為適合濃度。

2.4.3 發酵溫度對Monacolin K含量的影響 不同發酵溫度下液態發酵物中Monacolin K的含量見圖7，隨著溫度的升高，Monacolin K含量增高，在30℃時達到最高值，32℃產物的含量下降。這是因為溫度低時紅曲霉的生長和代謝都慢，產物積累少；而溫度過高時，紅曲霉生長快，達到對數期早，菌體自溶也早，不利于產物積累。

圖7 發酵溫度對紅曲霉產Monacolin K的影響Fig.7 Effectof fermentation temperature on Monacolin K contentof Monascus

2.4.4 起始pH對Monacolin K含量的影響 不同起始pH條件下Monacolin K含量見圖8，產物含量在pH 5.0時最高，pH升高或降低，產物的含量都呈降低趨勢，說明pH 5.0時紅曲霉的生長代謝適合產物Monacolin K的積累，是最適起始pH。

圖8 起始pH對紅曲霉產Monacolin K的影響Fig.8 The effectof pH on Monacolin K contentof Monascus

2.5 正交實驗

選取甘油含量、蛋白胨含量、發酵溫度及液體培養基起始pH四個因素進行正交實驗，正交實驗結果見表10。

由表10可知，各因素中發酵溫度對發酵產物中Monacolin K的含量影響最大，發酵液中甘油的含量次之，再次是發酵液中蛋白胨的含量，發酵液起始pH影響最小，即C＞A＞B＞D。最優發酵條件組合為A4B3C2D3，即甘油含量9%，蛋白胨含量1.0%，發酵溫度30℃，發酵液起始pH 5.0。

表10 紅曲霉發酵正交實驗結果Table1 0 Results of orthogonal testof Monascus fermentation

2.6 驗證實驗及液態發酵時間的確定

圖9 不同發酵時間Monacolin K含量Fig.9 Monacolin K contents at different fermentation time

根據單因素實驗和正交實驗結果，確定發酵培養基：甘油含量9%，大米水解液2%，蛋白胨含量1.0%，硫酸鎂0.1%，硫酸鋅0.2%，磷酸二氫鉀0.25%，豆芽汁補至1000m L，pH 5.0，加入0.1mol/L的EDTA 40μL[13]。接種量6%，發酵溫度30℃，搖床轉速150r/m in。發酵14d，每天測定Monacolin K含量。結果見圖9，Monacolin K含量在12d時達到最高為264.7μg/m L，12d后Monacolin K含量逐漸降低，由此可知，紅曲霉的最佳發酵時間為12d，Monacolin K最高產量為264.7μg/m L，此時桔霉素含量僅為0.026ng/m L。

3 結論

通過UV誘變、氯化鋰誘變以及硫酸二乙酯與氯化鋰復合誘變三次誘變選育，篩選出紅曲霉突變菌株MS-12，其固態發酵Monacolin K產量為1.346mg/g，提高顯著，且MS-12菌株與出發菌株相比桔霉素含量變化不大。經過發酵條件的優化，MS-12在液態發酵條件下Monacolin K的含量達到264.7μg/m L，而桔霉素的含量僅為0.026ng/m L。

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