滸苔生物有機(jī)肥的制備及其對(duì)櫻桃蘿卜品質(zhì)影響的研究

李銀平，王 進(jìn)，于 源，王 鵬

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

滸苔（Enteromorpha prolifera）分類學(xué)上屬綠藻門（Chlorophyta），石莼目（Ulvales），石莼科（Ulvaleae），滸苔屬（Enteromorpha）[1]。由于近年來海水營養(yǎng)成分發(fā)生變化，滸苔泛濫，影響海洋生態(tài)環(huán)境，國家每年投入大量的人力財(cái)力來處理這種“海洋垃圾”。當(dāng)今，滸苔的防治與應(yīng)急處理已經(jīng)成為海洋國家亟待解決的難題，同時(shí)滸苔的無害化、高值化利用成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

滸苔含有作物所需的豐富營養(yǎng)物質(zhì)和多種活性物質(zhì)，其中蛋白含量為9%～14%，脂肪1.04%，灰分32%～36%[2-3]。另外，還含有滸苔活性多糖、藻朊酸和脂肪酸等小分子有機(jī)物及鈣、鎂、碘、鋅等微量元素[4]。滸苔已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、飼料、食品、醫(yī)藥得到研究和應(yīng)用。滸苔的營養(yǎng)成分豐富，能夠?qū)⑵浣到庾鳛榉柿蠎?yīng)用到農(nóng)業(yè)中，即解決了“海洋垃圾”，又為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)增加了一種高效有機(jī)類肥料。如何才能將滸苔降解，菌種的選擇是關(guān)鍵因素。目前廣泛研究的發(fā)酵肥料菌屬有：放線菌、固氮菌、芽孢桿菌、酵母菌、光合細(xì)菌、霉菌等。降解的底物一般為纖維素、蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)復(fù)合物等。例如，顏霞等[5]從堆腐過程中的雙孢菇培養(yǎng)基質(zhì)中分離出了高溫降解纖維素的放線菌；劉紅艷等[6]從土壤中分離篩選出強(qiáng)解磷細(xì)菌和強(qiáng)解鉀細(xì)菌；牛四坤等[7]從魚池塘泥中篩選出了可高效降解水體中蛋白質(zhì)的菌株；趙妍嫣等[8]從土壤中篩選出多個(gè)降解淀粉的菌株。從以上研究可知，要想獲得良好的發(fā)酵效果，篩選出具有較強(qiáng)降解能力的目的菌株尤為重要。本文從腐爛滸苔中篩選出三株降解菌，為進(jìn)一步研究滸苔發(fā)酵并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)肥料奠定了基礎(chǔ)。

近年來，過量無機(jī)肥料的施入，導(dǎo)致土壤肥力大幅度下降，有機(jī)質(zhì)降低，微生物菌群數(shù)量降低等一系列問題[9]。為改善土壤結(jié)構(gòu)，綠色肥料的概念漸漸深入到農(nóng)業(yè)之中，并越來越受到國家的重視。新興的海藻肥料是繼化肥、秸稈糞便生物肥、有機(jī)肥之后的第四代肥料[10]。國內(nèi)對(duì)于海藻肥料的研究還處在未成熟階段，市場上海藻肥品種較少。本文利用自主篩選的混合微生物菌劑，將滸苔降解成易于作物吸收的小分子物質(zhì)，并配合有機(jī)輔料配制成一種營養(yǎng)元素多樣，有效成分含量豐富的滸苔生物有機(jī)肥。本文在滸苔發(fā)酵及其對(duì)作物品質(zhì)方面的研究，為海藻肥料的廣泛使用提供科學(xué)的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

初篩培養(yǎng)基 孟加拉紅和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基；復(fù)篩培養(yǎng)基 新鮮滸苔5g，酵母膏1g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0.5g，氯化鈣0.1g，氯化鈉10g，水1000m L，pH 7.0；腐爛滸苔 山東青島棧橋附近收集；新鮮滸苔 中國海洋大學(xué)生物工程開發(fā)有限公司提供；黃腐酸鉀、硅藻土、腐植酸、膨潤土、酵母發(fā)酵液干燥粉等輔料、櫻桃蘿卜種及供試土地 青島海夢(mèng)圓有機(jī)農(nóng)場提供，經(jīng)測(cè)定其土壤農(nóng)化成分含量為：總氮0.21%，總磷0.18%，總鉀0.30%，有機(jī)質(zhì)2.4%，pH 7.1。

DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-40B I型立式蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；2720ThermalCycler型PCR擴(kuò)增儀 Eppendorf Inc；DYY-2C型核酸電泳儀 北京市六一儀器廠；Tanon-4200型紫外凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；Adventuer電子精密天平 奧克斯國際貿(mào)易公司；電子游標(biāo)卡尺 臺(tái)灣寶工實(shí)業(yè)有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH.S21-4電熱恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市宏華儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵菌種的篩選和鑒定

1.2.1.1 發(fā)酵菌種的初篩 將收集的腐爛滸苔用無菌水進(jìn)行梯度稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6，并涂布于初篩培養(yǎng)基上，30℃恒溫倒置培養(yǎng)。挑選出在平板上生長快，菌落大的單菌落。將分離的單菌落進(jìn)行劃線分離，進(jìn)一步鏡檢并保存初篩菌株。

1.2.1.2 發(fā)酵菌種的復(fù)篩 將初篩后的菌種接種至復(fù)篩培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)。觀察滸苔的斷裂情況。并對(duì)菌種進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，將具有較高活性的菌種進(jìn)行斜面保存。

1.2.1.3 堆肥實(shí)驗(yàn) 以滸苔為原料，通過添加尿素調(diào)節(jié)發(fā)酵用物料的C/N為30∶1，利用復(fù)篩后的菌劑與本實(shí)驗(yàn)室已有的米曲霉對(duì)物料共同進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵。以未接復(fù)合菌群堆肥作為對(duì)照。定時(shí)觀察兩組的組織狀態(tài)。

1.2.1.4 菌種鑒定 a.16S rRNA基因分析：DNA的提取方法依據(jù)Li等[11]的方法擴(kuò)增，使用的16S通用引物為27F：5’-AGAGTTGATCATGGGTCAG-3’；1492R：5’-AAGGAGGTGATCCAACGCA-3’；b.18S rRNA基因分析：DNA的提取方法依據(jù)張亮[12]的方法擴(kuò)增，使用的18S通用引物為ITS-1：5’-CGTAACAAGGTTTCC GTAGG-3’；ITS-4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。測(cè)序由上海生工公司完成，序列比對(duì)在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行。

1.2.2 滸苔生物有機(jī)肥的制備 以滸苔為原料，通過添加尿素調(diào)節(jié)發(fā)酵用物料的C/N為30∶1，利用EM-L菌劑對(duì)物料進(jìn)行發(fā)酵。首先將配好的待發(fā)酵物轉(zhuǎn)入發(fā)酵池，再將預(yù)先培養(yǎng)的EM-L菌劑倒入池中，接種量為發(fā)酵物料總量的3%～5%，物料要充分混勻。發(fā)酵過程中，定期翻堆取樣檢測(cè)，翻堆要迅速、充分，整個(gè)周期為14d。將發(fā)酵完全的物料和有機(jī)輔料按一定比例充分混勻，即滸苔生物有機(jī)肥。同時(shí)將滸苔生物有機(jī)肥中的各輔料按照相同比例配制成對(duì)照組肥料，以下統(tǒng)稱為對(duì)照有機(jī)肥。

1.2.3 滸苔生物有機(jī)肥對(duì)櫻桃蘿卜的品質(zhì)影響 本實(shí)驗(yàn)設(shè)不施肥料的空白組為處理組1，施4t/hm2對(duì)照有機(jī)肥的對(duì)照組為處理組2，施滸苔生物有機(jī)肥1t/hm2（低施肥量實(shí)驗(yàn)組）、4t/hm2（中施肥量實(shí)驗(yàn)組）、7t/hm2（高施肥量實(shí)驗(yàn)組）三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別為處理組3、4、5。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行450棵櫻桃蘿卜。5月3號(hào)種植，6月5號(hào)采收，整個(gè)生長期為33d通過對(duì)櫻桃蘿卜的單棵重、單顆直徑、還原糖含量和葉綠素含量等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并以此判斷滸苔生物有機(jī)肥的肥效。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定方法 櫻桃蘿卜的單棵重用電子天平直接稱量，單顆直徑用游標(biāo)卡尺直接測(cè)量，還原糖含量采用3，5-二硝基水楊酸法[13]，葉綠素含量采用分光光度比色法[14]，腐熟過程中的物料C/N按照國家NY 525-2002有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)中所述方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的圖表處理和單因素方差分析。并用Excel 2003軟件進(jìn)行SSR多重比較檢驗(yàn)法[15]檢驗(yàn)處理組間的差異程度，以p＜0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的篩選和鑒定

2.1.1 發(fā)酵菌種的篩選 在初篩過程中，共篩選出13株細(xì)菌和7株酵母菌。將初篩得到的菌株分別接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，大部分菌株由于對(duì)新鮮滸苔的降解能力較差而被淘汰；經(jīng)過反復(fù)復(fù)篩，最終獲得3株降解能力較強(qiáng)且穩(wěn)定的菌株。

2.1.2 發(fā)酵菌種的鑒定及命名 分別對(duì)細(xì)菌的16S rRNA和真菌的18S rRNA擴(kuò)增后，將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果表明本次篩選的3個(gè)菌株分別為：米根霉、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌。菌株比對(duì)結(jié)果如下表1所示。將這三個(gè)菌株同實(shí)驗(yàn)室已有的發(fā)酵菌株“米曲霉”共同命名為EM-L菌劑。

2.2 滸苔發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定

以EM-L菌劑發(fā)酵滸苔，在發(fā)酵過程中定期觀察取樣并測(cè)定發(fā)酵物料的溫度、高度和C/N等指標(biāo)，測(cè)定結(jié)果如圖1所示。觀察發(fā)酵后滸苔，其顏色發(fā)黑，組織腐爛，呈流體狀。而無添加EM-L菌劑的對(duì)照組滸苔在發(fā)酵周期結(jié)束后，其原滸苔綠色變淺，組織基本無斷裂，仍保持完整。滸苔在EM-L菌劑的作用下，在14d的發(fā)酵周期中，物料的溫度變化明顯，第2d即升到50℃以上，在第3d溫度達(dá)到最高為65℃。之后溫度緩慢下降，第8d溫度達(dá)到40℃，并保持平穩(wěn)。物料高度在整個(gè)發(fā)酵期逐漸下降，前3d下降較快，11d之后維持在19cm高度，并保持穩(wěn)定。物料C/N值從30逐漸下降到16，后期保持穩(wěn)定。

2.3 滸苔生物有機(jī)肥的成分測(cè)定

根據(jù)NY 525-2002有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)對(duì)滸苔進(jìn)行成分含量測(cè)定，滸苔成分含量（以濕基計(jì)）為：總氮0.62%，全磷0.04%，全鉀0.68%，有機(jī)質(zhì)10.12%。本實(shí)驗(yàn)研究的滸苔生物有機(jī)肥主要成分為滸苔、腐植酸、膨潤土和酵母發(fā)酵液干燥粉等有機(jī)物料。根據(jù)國標(biāo)NY 525-2002對(duì)滸苔生物有機(jī)肥成分含量測(cè)定，結(jié)果見表2。從以下各指標(biāo)可以看出，本滸苔有機(jī)肥各指標(biāo)均符合國家有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)，是嚴(yán)格按照該標(biāo)準(zhǔn)配制的一種新型海藻類生物有機(jī)肥。

2.4 滸苔生物有機(jī)肥對(duì)櫻桃蘿卜的生長影響

圖1 滸苔發(fā)酵過程中各指標(biāo)變化Fig.1 The changes of each index in the the fermentation process of Enteromorpha prolifera

表1 菌種鑒定結(jié)果Table1 The identification results of selected strains

表2 滸苔生物有機(jī)肥成分含量Table2 The concentof the componentof Enteromorpha prolifera bio-organic fertilizer

通過在櫻桃蘿卜生產(chǎn)中增施滸苔生物有機(jī)肥，并在采收時(shí)隨機(jī)抽樣，測(cè)定果實(shí)重量、直徑和還原糖等。從表3中可以看出，隨著滸苔生物有機(jī)肥施肥量的增加，重量和直徑均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。中施肥量實(shí)驗(yàn)組在重量和直徑兩個(gè)指標(biāo)中表現(xiàn)出最高水平，比對(duì)照組分別增加3.29%和3.81%。但兩個(gè)處理組組間的重量和直徑指標(biāo)均無顯著差異。低施肥量實(shí)驗(yàn)組對(duì)櫻桃蘿卜的還原糖含量影響最大，比對(duì)照組增加4.11%，中施肥量實(shí)驗(yàn)組（增加0.64%）次之。綜合比較說明，4t/hm2為滸苔生物有機(jī)肥的最佳施肥量，對(duì)櫻桃蘿卜的重量及糖含量的促進(jìn)作用顯著，滸苔生物有機(jī)肥的施肥量達(dá)到7t/hm2之后對(duì)櫻桃蘿卜的生長有明顯的抑制作用。對(duì)照有機(jī)肥對(duì)櫻桃蘿卜的重量、糖含量的提高也有明顯的效果，但與最佳施肥量的滸苔生物有機(jī)肥下的櫻桃蘿卜生長情況相比，各指標(biāo)都較低。

表3 滸苔生物有機(jī)肥對(duì)櫻桃蘿卜單棵重量、單顆直徑、還原糖含量的影響Table3 The effects of Enteromorpha prolifera bio-organic fertilizer on theweight，diameter and reducing sugar of Cherry Radish

櫻桃蘿卜成熟后，進(jìn)行隨機(jī)取樣并對(duì)葉片葉綠素含量進(jìn)行檢測(cè)評(píng)定，空白組植株葉片局部有發(fā)黃現(xiàn)象，表現(xiàn)出缺肥癥狀；對(duì)照組植株葉片呈現(xiàn)出淺綠色，無發(fā)黃葉片；施用滸苔生物有機(jī)肥植株葉片深綠，無黃葉、爛葉。從圖2的數(shù)據(jù)中也可以看出，滸苔生物有機(jī)肥對(duì)于櫻桃蘿卜的葉片葉綠素含量有明顯的促進(jìn)作用，而且隨著肥施肥量的增加，葉綠素含量呈遞增趨勢(shì)。施用滸苔生物有機(jī)肥的實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組與空白組的葉綠素含量。

圖2 滸苔生物有機(jī)肥對(duì)櫻桃蘿卜葉綠素含量的影響Fig.2 The effectof Enteromorpha prolifera bio-organic fertilizer on chlorophyll content of Cherry Radish

3 討論

3.1 發(fā)酵菌種的篩選和鑒定

經(jīng)復(fù)配的EM-L菌劑是由多種真菌和細(xì)菌組成的微生物群系。對(duì)纖維素分解能力較強(qiáng)的菌株大多為真菌屬[16]，其中屈二軍[17]、馬光[18]、管海華等[19]均報(bào)道了米曲霉可以分泌纖維素酶。此外，米曲霉具有生長快、產(chǎn)孢子量大、不產(chǎn)毒素等特點(diǎn)[16]。EM-L菌劑中的枯草芽孢桿菌[20]可以分泌蛋白酶以分解滸苔原料中的蛋白質(zhì)，從而生成利于作物吸收的小分子肽類化合物。根霉是霉菌中一種具有多酶系特征的霉菌，它除了能分泌淀粉酶外，還能分泌酸性蛋白酶，酒化酶及乳酸、琥珀酸等多種有機(jī)酸及乙醇等[21]。蠟狀芽孢桿菌可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的營養(yǎng)成分，改善生態(tài)環(huán)境，有耐高溫、耐酸堿、耐溫度變化等特點(diǎn)[22]。綜合以上各菌株的性質(zhì)，各菌株之間具有良好的協(xié)同效應(yīng)。在滸苔發(fā)酵過程中，在各微生物群系共同作用下能夠達(dá)到對(duì)滸苔的加速分解，將滸苔中的纖維素、蛋白質(zhì)、碳水化合物等有機(jī)物徹底降解成作物所能吸收的小分子物質(zhì)。

3.2 物料在發(fā)酵過程中的指標(biāo)變化

對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)的滸苔進(jìn)行感官評(píng)定，其顏色已完全失去原有的滸苔綠色，變?yōu)樯詈谏唤M織降解充分，呈半流體狀，無明顯臭味。物料在發(fā)酵的過程中，由于各種微生物的活動(dòng)產(chǎn)熱，使得料體溫度升高，又由于本實(shí)驗(yàn)所用菌種由米曲霉、芽孢桿菌等多種屬菌種組成，具有產(chǎn)多酶類、有機(jī)物種類降解全面和產(chǎn)熱快的特點(diǎn)，所以物料溫度在前期即可升到50℃以上。隨著微生物的不斷繁殖，溫度隨之升高，最高達(dá)到65℃。到了發(fā)酵后期，由于營養(yǎng)物質(zhì)和外界環(huán)境的變化，導(dǎo)致微生物活動(dòng)減弱，數(shù)量減少，進(jìn)而物料溫度下降直至達(dá)到穩(wěn)定。另外，微生物對(duì)物料的作用，使得滸苔組織降解，交聯(lián)度下降，從而表現(xiàn)出料體高度的下降。微生物在生長繁殖過程中，大量地利用物料中的碳源和氮源，并產(chǎn)生二氧化碳和氨氣排出料體之外[23]。微生物對(duì)碳源的需要量大于氮源，導(dǎo)致C/N值逐漸減小，由30降到16。根據(jù)劉更正[24]、Marco Grigatti[25]的研究，C/N是檢驗(yàn)物料發(fā)酵程度的一個(gè)重要指標(biāo)，堆肥的C/N值達(dá)到20以下就認(rèn)為已發(fā)酵結(jié)束，可以直接使用。本實(shí)驗(yàn)研究的物料發(fā)酵后的C/N值為16，說明物料已經(jīng)發(fā)酵完全，能夠作為肥料原料使用。

3.3 滸苔生物有機(jī)肥對(duì)櫻桃蘿卜的生長影響

本實(shí)驗(yàn)研究的滸苔生物有機(jī)肥成分豐富，不僅含有滸苔所特有的滸苔多糖、藻朊酸和脂肪酸等小分子有機(jī)物質(zhì)，并且其氮、磷、鉀和有機(jī)質(zhì)總量高于國家NY 525-2002有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)。此外，該肥料還具有活化生物體內(nèi)多種轉(zhuǎn)化酶和過氧化物酶，促進(jìn)植物細(xì)胞分裂，刺激植物生長等多種生理活性[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，櫻桃蘿卜在施用了滸苔生物有機(jī)肥之后，相對(duì)于對(duì)照有機(jī)肥，其果實(shí)的重量、直徑、還原糖含量和葉片葉綠素含量都在不同程度上得到增加。櫻桃蘿卜的塊莖膨大主要依靠氮源，滸苔生物有機(jī)肥氮源豐富，為其提供了大量的生長營養(yǎng)元素。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，也是衡量植物光合作用能力的重要指標(biāo)之一[27]。葉綠素有兩部分組成，卟啉環(huán)和葉綠醇，卟啉環(huán)的結(jié)構(gòu)中包含鎂元素。此外，葉綠素的前體為鋅卟啉，需要鋅元素來合成[28]。滸苔生物有機(jī)肥含有大量的鎂、鋅等礦質(zhì)元素[3，26]，為葉綠素的合成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。從實(shí)驗(yàn)中得出，中、低施肥量下，櫻桃蘿卜葉的葉綠素含量與滸苔生物有機(jī)肥的施肥量呈正相關(guān)。但在高施肥量下，櫻桃蘿卜的果實(shí)較小，說明過多滸苔生物有機(jī)肥的施用會(huì)抑制櫻桃蘿卜的生長。果實(shí)的還原糖含量是衡量其口感和品質(zhì)的一個(gè)指標(biāo)[29]，其含量越高，口感越好，品質(zhì)也越高。當(dāng)櫻桃蘿卜的滸苔生物有機(jī)肥的施用量為1、4t/hm2時(shí)，其還原糖含量高于空白組含量，對(duì)櫻桃蘿卜的品質(zhì)有提高作用。

4 結(jié)論

經(jīng)分離篩選得到的米根霉、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌菌與米曲霉復(fù)配得到EM-L菌劑。各菌株之間具有良好的協(xié)同作用，能夠達(dá)到對(duì)滸苔的加速分解。以發(fā)酵滸苔作為主要原料制備得到的滸苔生物有機(jī)肥，其成分含量指標(biāo)符合相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)。滸苔生物有機(jī)肥相對(duì)于對(duì)照有機(jī)肥對(duì)櫻桃蘿卜的重量和還原糖含量的增加作用明顯。結(jié)果表明，滸苔生物有機(jī)肥的最佳施肥量為4t/hm2，該施肥量對(duì)櫻桃蘿卜在產(chǎn)量和品質(zhì)上都有促進(jìn)作用。

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