氟伐他汀對高糖培養大鼠腎小球系膜細胞CTGFmRNA的影響及其作用機制的研究

王麗暉，吳廣禮，張麗霞，李 賽，黃旭東

氟伐他汀對高糖培養大鼠腎小球系膜細胞CTGFmRNA的影響及其作用機制的研究

王麗暉，吳廣禮，張麗霞，李 賽，黃旭東

目的探討高糖狀態下腎小球系膜細胞中結締組織生長因子(CTGF)mRNA的表達以及HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀對其的影響及作用機制。方法 體外培養大鼠腎小球系膜細胞，實驗分為4組:低糖組(LG組，5．5 mmol/L葡萄糖);低糖 +甘露醇組(LG+M組，5．5 mmol/L葡萄糖 +24．5 mmol/L甘露醇);高糖組(HG組，30 mmol/L葡萄糖);高糖+氟伐他汀組(HG+Flu組，30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L氟伐他汀)。采用逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測CTGF和纖維粘連蛋白(FN)mRNA的表達，Western印跡檢測磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)及其下游因子cAMP反應元件結合蛋白1(p-CREB1)。結果 與LG+M組相比，HG組系膜細胞增殖明顯，p-p38 MAPK、p-CREB1表達明顯上調，CTGF和FNmRNA的表達增加。與HG組比較，HG+Flu組可抑制系膜細胞增殖，p-p38 MAPK、p-CREB1的表達明顯下調，CTGF和FNmRNA的表達降低。結論 高糖狀態下腎小球系膜細胞CTGFmRNA表達增強，p-p38 MAPK和p-CREB1表達明顯升高，氟伐他汀抑制腎小球系膜細胞CTGFmRNA和細胞外基質的分泌可能部分是通過影響p38 MAPK及其下游核因子CREB1的激活而實現。

系膜細胞;HMG-CoA還原酶抑制劑;結締組織生長因子;p38絲裂原活化蛋白激酶;cAMP反應元件結合蛋白1;氟伐他汀;大鼠，Wistar

結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)作為轉化生長因子-β1(TGF-β1)的下游因子，是目前頗受關注的促進細胞和組織纖維化的重要細胞因子，在腎小球硬化和腎間質纖維化中發揮一定作用［1-4］。p38絲裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated Protein Kinase，p38 MAPK)途徑在高血糖和血管緊張素Ⅱ的作用下被激活，在糖尿病腎病的發生發展中發揮一定的作用，是近年來備受關注的細胞內重要信號轉導途徑［5］。以往研究表明，羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑洛伐他汀能夠抑制糖尿病大鼠腎組織細胞外基質的蓄積，延緩糖尿病腎病的發展［6-7］，其非依賴降脂的抑制細胞增殖作用越來越受到人們的重視。為進一步探討HMG-CoA還原酶抑制劑對糖尿病腎病可能的保護作用及機制，本實驗通過體外培養大鼠腎小球系膜細胞，觀察HMG-CoA還原酶抑制劑(Statins)氟伐他汀對高糖培養系膜細胞CTGF和細胞外基質蛋白表達的影響，同時觀察p38 MAPK下游因子cAMP反應元件結合蛋白1(cAMP response elementbingding protein，p-CREB1)的表達，以探討氟伐他汀可能的腎臟保護機制。

1 材料和方法

1.1 材料 氟伐他汀(粉劑)由北京諾華制藥有限公司饋贈。健康清潔級雄性Wistar大鼠，體重100～150 g，由河北省實驗動物中心提供，實驗動物合格證號701073。小鼠抗p-p 38 MAPK單克隆抗體，小鼠抗p-CREB1單克隆抗體，ECL增強化學發光試劑盒均購自Santa Cruz公司，RT-PCR試劑購自Promega公司產品，Ⅳ型膠原酶購自Sigma公司。辣根酶標記羊抗小鼠或兔IgG由北京中山公司進口分裝。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自Milipore公司。

1.2 系膜細胞的分離培養和刺激實驗 Wistar大鼠乙醚麻醉后，無菌條件下取出腎臟(手術器械均經200℃烘烤4 h消毒)，用4℃ D-Hanks液沖洗腎臟，去掉被膜，小心分離腎皮質并將其剪成1～2 mm的3小塊。將腎皮質碎塊用D-Hanks液洗滌2～3次，分別經80、140和200目不銹鋼篩網，收集200目的腎小球，加入0．1%Ⅳ型膠原酶消化后，離心收集被消化的腎小球，加入PRMI1640完全培養液(含體積分數0.2胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，100 kU/L青霉素，100mg/L鏈霉素，0.66 kU/L胰島素)，于37℃、5%CO2孵箱中培養，4～6 d首次換液。以后每2～3 d換液1次，約2～3周系膜細胞長滿培養瓶底，應用相差倒置顯微鏡觀察細胞形態。將第3代系膜細胞接種于24孔板，48 h后用PBS沖洗系膜細胞，乙醇固定30 min，再分別用兔抗大鼠結蛋白(desmin)、角蛋白、Ⅷ因子單克隆抗體為一抗，行SP法，DAB顯色，陽性信號呈棕黃色或褐色。抗desmin抗體陽性，抗角蛋白、Ⅷ因子陰性表明所鑒定的細胞為系膜細胞。0．25%胰蛋白酶消化傳代，取4～10代細胞用于實驗研究。將細胞分為4組:低糖組(LG組，5．5 mmol/L葡萄糖);低糖+甘露醇組(LG+M 組，5．5 mmol/L 葡萄糖 +24．5 mmol/L甘露醇);高糖組(HG組，30 mmol/L葡萄糖);高糖+氟伐他汀組(HG+Flu組，30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L氟伐他汀)。刺激48 h后收集細胞，分別提取蛋白、RNA及細胞上清液。

1.3 MTT法檢測系膜細胞增殖水平 取第4代系膜細胞應用胰酶消化，加入含15%胎牛血清的RPMI1640培養液于離心管中，反復吹打，混勻，按每孔200μl，密度4000/孔接種于96孔板中。待系膜細胞貼壁24 h后，加無血清培養液200μl，同步24 h，使細胞同步于G0期。每6孔細胞為一組，按1．2的分組進行刺激，刺激時間分別為12、24、48 h。此外，觀察不同氟伐他汀濃度(1、10、20μmol/L)對高糖狀態下系膜細胞增殖的影響，選擇刺激時間為48 h。將細胞置于 37℃、5%CO2孵箱培養，加入 MTT(5 g/L)，于4 h后每孔分別加入DMSO，用酶標儀觀察，在490 nm波長處記錄A值。

1.4 逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測CTGF和纖維粘連蛋白(fibronectin，FN)mRNA的表達應用Trizol試劑提取細胞總RNA，用紫外－可見分光光度儀測定其純度和含量。在逆轉錄酶催化下合成cDNA，以適量cDNA為模板在TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增。CTGF上下游引物:5'-GCCTCAAACTCCAAACACCATC-3'和5'-CAGCAAACACTTCCTCGTGGA-3'，擴增產物:252 bp。FN上下游引物:5'-CTGAACCAGCCTACGGATGACT-3'和 5'-CCGTCGTCATAACACGTTGCT-3'， 擴 增 產 物:305 bp。GAPDH上下游引物為:5'-TATCGGACGCCTGGTTAC-3'和 5'-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3'，擴增產物為140 bp。所用引物均由上海生工生物公司合成。CTGF和FN的擴增條件為:預變性94℃、5 min，進入循環，94℃、0 s，退火溫度分別為58℃和56．9℃、60 s，72℃、60 s，30 個循環后 72℃、8 min。將PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，置于凝膠圖像分析系統(UVP公司，美國)進行吸光度掃描，以管家基因GAPDH作為內參照校正，用目的基因吸光度與GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量。

1.5 Western印跡檢測p-p38 MAPK和p-CREB1的表達 細胞用冰冷PBS(1 mmol/L正釩酸鈉)沖洗2遍，加入細胞裂解液(20 mmol/L Tris HCl，2．5 mmol/L EDTA，體積分數0．1甘油，質量濃度10 g/L的SDS，體積分數0．01的 TritonX100，質量濃度50 g/L去氧膽酸鈉，10 mmol/L焦磷酸鈉，50 mmol/L氟化鈉，1 mmol/L正釩酸鈉，質量濃度1 g/L苯甲基磺酰氟)，冰浴1 h，于4℃、14000 r/min 離心25 min，應用Lowry法測定上清液蛋白濃度。取細胞裂解蛋白50μg，經8%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺(SDS PAGE)凝膠電泳后電轉移至PVDF膜;5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入小鼠抗p-p38 MAPK和抗p-CREB1單克隆抗體。抗體經過1∶200稀釋，4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔抗體(1∶5000 稀釋)，37℃ 孵育 1．5 h，洗膜后加ECL試劑，然后將PVDF膜放入X光片暗盒、壓片、顯影、定影。用美國UVP公司LabWorks4．5分析系統軟件對Western條帶進行定量分析，確定雜交條帶的吸光度值。

1.6 統計學處理 采用SPSS 11．0統計軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 腎小球系膜細胞的鑒定 倒置相差顯微鏡下見系膜細胞呈梭形、不規則星形或樹枝狀，生長旺盛時多呈梭形。HE染色見系膜細胞胞漿向外伸出數個長短不一的突起，核清晰位于細胞中央，呈圓形或橢圓形(圖1)。染色顯示細胞胞漿結蛋白陽性(圖2)，角蛋白、Ⅷ因子陰性，從而證明這些細胞為系膜細胞而非腎小球上皮細胞或內皮細胞。

圖1 大鼠腎小球系膜細胞(HE×200)圖2 結蛋白在大鼠腎小球系膜細胞中表達(DAB×200)

2.2 氟伐他汀對系膜細胞增殖的影響 LG組與LG+M組差異無統計學意義(P＞0.05);與LG+M組相比，高糖能夠促進系膜細胞增殖，并隨時間延長更加明顯;10μmol/L氟伐他汀作用24 h和48 h后，能夠抑制高糖對系膜細胞的促增殖作用(表1)。1、10和20μmol/L氟伐他汀對高糖培養系膜細胞增殖都有抑制作用，并且隨藥物濃度的增加抑制作用更加明顯(表2)。2.3 RT-PCR檢測CTGF和FN mRNA的表達 LG組與LG+M組差異無統計學意義(P＞0.05);與LG+M組相比，高糖刺激48 h可以使系膜細胞CTGF和FN mRNA升高(P＜0．05)，分別是LG組的2．31和3．42倍;與 HG 組相比，HG+Flu組 CTGF和FN mRNA的表達明顯降低(P＜0．05)，分別降低了34%和55%。見表3、圖3。

表1 不同刺激時間對4組大鼠腎臟系膜細胞增殖的影響(±s)

表1 不同刺激時間對4組大鼠腎臟系膜細胞增殖的影響(±s)

注:LG組，加入 5．5 mmol/L葡萄糖;LG+M組，加入5．5 mmol/L葡萄糖 +24．5 mmol/L 甘露醇;HG 組，加入30 mmol/L葡萄糖;HG+Flu組，加入30 mmol/L葡萄糖 +10μmol/L氟伐他汀。與 LG+M 組比較，a P＜0.05，b P＜0.01;與HG組比較，c P＜0.05

12 h 24 h 48 h LG組組別 孔數 A值6 0．281 ±0．018 0．312 ±0．027 0．456 ±0．031 LG+M 組 6 0．267 ±0．019 0．337 ±0．030 0．473 ±0．021 HG 組 6 0．364 ±0．016a 0．481 ±0．057b 0．692 ±0．043b HG+Flu組 6 0．295 ±0．015c 0．354 ±0．043c 0．469 ±0．037c

表2 不同濃度氟伐他汀對4組大鼠腎臟系膜細胞增殖的影響(±s)

表2 不同濃度氟伐他汀對4組大鼠腎臟系膜細胞增殖的影響(±s)

注:HG組，加入30 mmol/L葡萄糖;HG+Flu組，加入30 mmol/L葡萄糖+氟伐他汀。與HG組比較，b P＜0．01

組別 Flu濃度(μmol/L) 孔數 A值HG組6 0．350 ±0．023 HG+Flu 組 1 6 0．227 ±0．026b 10 6 0．174 ±0．018b 20 6 0．136 ±0．015－b

表3 4組大鼠腎臟系膜細胞中CTGF、FN mRNA的表達(±s)

表3 4組大鼠腎臟系膜細胞中CTGF、FN mRNA的表達(±s)

注:CTGF:結締組織生長因子;FN:纖維粘連蛋白;LG組，加入5．5 mmol/L葡萄糖;LG+M組，加入5．5 mmol/L葡萄糖+24．5 mmol/L甘露醇;HG組，加入30 mmol/L葡萄糖;HG+Flu組，加入30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L氟伐他汀。與 LG+M 組比較，a P ＜0．05;與 HG 組比較，c P ＜0．05

組別 孔數CTGF FN LG組6 0．328 ±0．015 0．417 ±0．013 LG+M 組 6 0．321 ±0．011 0．415 ±0．015 HG 組 6 0．867 ±0．035a 0．953 ±0．025a HG+Flu 組 6 0．625 ±0．018c 0．641 ±0．024c

2.4 Western印跡檢測結果 LG組與LG+M組差異無統計學意義(P＞0.05);與LG+M組相比，高糖組p-p38 MAPK和 p-CREB1表達上調(P＜0.01)。HG+Flu組p-p38 MAPK和p-CREB1表達下調(P＜0.01)。見圖4、表4。

圖3 4組大鼠腎臟系膜細胞結締組織生長因子和纖維粘連蛋白RT-PCR結果

圖4 4組大鼠腎臟系膜細胞中p38 MAPK、CREB1蛋白的表達

表4 4組大鼠腎臟系膜細胞中p38 MAPK，CREB1蛋白的表達(±s)

表4 4組大鼠腎臟系膜細胞中p38 MAPK，CREB1蛋白的表達(±s)

注:LG組，加入 5．5 mmol/L葡萄糖;LG+M組，加入5．5 mmol/L葡萄糖 +24．5 mmol/L 甘露醇;HG 組，加入30 mmol/L葡萄糖;HG+Flu組，加入30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L氟伐他汀。與 LG+M組比較，a P＜0.05;與 HG組比較，c P ＜0．05

組別 孔數p-p38 MAPK p-CREB1 LG組6 0．213 ±0．015 0．239 ±0．014 LG+M 組 6 0．254 ±0．011 0．241 ±0．012 HG 組 6 0．541 ±0．032a 0．398 ±0．021a HG+Flu 組 6 0．228 ±0．008c 0．249 ±0．012c

3 討論

Statins是臨床上常用的降脂藥物，通過阻斷細胞內甲羥戊酸代謝途徑，使細胞膽固醇和多種非甾醇異戊二烯產物的生成減少，從而降低膽固醇的產生。但是，近年來Statins非依賴降脂的腎臟保護作用得到人們的關注。主要表現在可以有效減輕腎臟細胞增殖肥大和細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)的積聚，減輕尿蛋白排泄量［8］。系膜細胞作為腎小球內最活躍的固有細胞，能夠產生ECM、分泌細胞因子、吞噬和清除異物等多種功能，其功能異常與多種腎臟疾病的發生、發展有關。體外實驗結果表明，Statins可以抑制系膜細胞增殖，阻斷系膜細胞分泌ECM［9］。本實驗結果也表明氟伐他汀可以明顯抑制高糖作用48 h時FN分泌和mRNA的表達，可抑制高糖培養下系膜細胞分泌ECM。這與文獻報道一致［10-11］。本研究特意設立LG+M組，其滲透壓與HG組基本一致，進一步除外高糖導致的高滲透壓對系膜細胞的影響。

CTGF是由349個氨基酸組成的相對分子質量為34 000～38 000的富含半胱氨酸的分泌肽，被視為TGF-β1/Smad通路中的下游效應介質［12］。有研究表明，statins能夠減輕系膜細胞ECM的分泌，可能與其能夠減輕TGF-β1的表達有關［13］。在CTGF啟動子序列128～162位置上存在著一個重要的TGF-β1調控元件，TGF-β1通過調控CTGF啟動子內TGF-β1反應元件和Smad結合元件誘導CTGF的產生，在病理情況下，可誘發及增加Ⅰ型膠原等的合成，使ECM合成增加，從而導致纖維化［14］。本研究表明，高糖可以引起系膜細胞CTGF mRNA表達的升高，CTGFmRNA表達的增加，正是系膜細胞分泌ECM增多的原因之一，從而引起糖尿病腎小球的硬化。而氟伐他汀則能夠抑制高糖刺激下系膜細胞中促纖維化因子CTGF和FN mRNA的表達，提示氟伐他汀抑制系膜細胞ECM的分泌可能是通過抑制CTGF的表達來實現的。

p38 MAPK途徑是近年來倍受關注的一條細胞內重要的信號轉導途徑，高糖刺激使之活化后可以激活多種核轉錄因子，影響目的基因的表達［15］。有研究認為，無論在糖尿病腎病的早期還是發展階段，p38 MAPK可能均發揮重要作用［16］，影響TGF-β因子的合成［17］，促進系膜細胞及腎小管細胞的凋亡等［18］。本實驗結果顯示高濃度葡萄糖能夠激活腎小球系膜細胞p38 MAPK和CREB1，使其磷酸化水平明顯增高，進一步提示p38 MAPK信號途徑可能參與了糖尿病腎病的發病過程。但氟伐他汀可以明顯阻斷系膜細胞p38 MAPK和CREB1的磷酸化水平。提示氟伐他汀能夠阻斷高糖狀態下系膜細胞CTGFmRNA的表達，可能是通過阻斷p38 MAPK信號轉導途徑，降低CTGF的表達，從而降低FN的表達來實現的。此外有研究表明，FN作為ECM的主要成分之一，同時又是CREB的作用底物，其啟動子在其序列的170 bp含有CRE，所以激活后的CREB可以結合在這個CRE上，導致FN mRNA表達增強［19］。氟伐他汀阻斷 p38 MAPK及其下游因子CREB1后，可以有效阻斷FN的合成。

綜上所述，氟伐他汀能夠產生腎臟保護作用，而這種作用可能是通過抑制p38 MAPK信號途徑的激活，進一步抑制CTGF過度表達，減少細胞外基質蛋白的生成，調節細胞的增殖狀態，從而產生明顯的腎臟保護作用。

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Effect and Functional Mechanisms of Fluvastatin on the Expressions of Connective Tissue Growth Factor m RNA in G lomerular Mesangial Cells Cultivated with High Concentration of Glucose in Rats

WANG Li-hui，WU Guang-li，ZHANG Li-xia，LISai，HUANG Xu-dong(Department of Nephrology，Bethune International Peace Hospital of PLA，Shijiazhuang 050082，China)

ObjectiveTo investigate the effectand functionalmechanisms of Fluvastatin on the expression of connective tissue growth factor(CTGF)mRNA and the activation of p38mitogen-activated protein Kinase(p38 MAPK)and cAMP response element－bingding protein1(CREB1)in glomerularmesangial cells cultivated with high concentration of glucose in rats．MethodsGlomerularmesangial cells in Wistar rats were cultured in vitro and divided into four groups:low glucose group(group LG，5．5mmol/L glucose)，low glucosewithmannitol group(group LG+M，5．5mmol/L glucose+24．5mmol/Lmannitol)，high glucose group(group HG，30mmol/L glucose)and high glucose with Fluvastatin group(group HG+Flu，30mmol/L glucose+10μmol/LFluvastatin)．Expressions of mRNA in CTGFand fibronectin(FN)were detected by reverse transcription and polymerase chain reaction(RT-PCR)．Expressions of phosphorylated p38(p-p38)mitogen activated protein kinase(MAPK)and p-CREB1 were detected by Western blotting．ResultsThe intercapillary cellmultiplication and expressions of p-p38MAPK，p-CREB1 andmRNA of CTGF and FN were significantly increased in group HG，compared with those in group LG+M．The intercapillary cellmultiplication could be inhibited，and expressions of p-p38 MAPK ，p-CREB1 and mRNA of CTGFand FN were significantly lower in group HG+Flu，compared with those in group HG．ConclusionThe expressions of CTGFmRNA，p-p38MAPK and p-CREB1may be significantly increased in glomerularmesangial cellsunder high concentration of glucose，and Fluvastatin can inhibit production of CTGF and extracellularmatrix(ECM)proteins partly by regulating the phosphorylation of p38MAPK and CREB1．

Mesangial cell;Hydroxymethylglutaryl-coA reductase inhibitors;Connective tissue growth factor;p38 mitogen activated protein kinase;cAMP response element－ bingding protein1;Fluvatatin;Rat，wistar

R-332;R963

A

2095-140X(2013)12-0057-05

10．3969/j．issn．2095-140X．2013．12．015

河北省科技攻關計劃課題資助項目(072761188)

050082石家莊，解放軍白求恩國際和平醫院腎臟病科

2013-08-19 修回時間:2013-09-24)