杞藿飲對力竭游泳大鼠肝細胞衰老及其超微結構的影響

徐紀平，劉保海，孫金山，肖立寧，陳來國，黃 文，李兆申

古今中外的戰(zhàn)爭史均已證實，作戰(zhàn)疲勞是影響部隊戰(zhàn)斗力的重要原因，如何在長時間持續(xù)作戰(zhàn)中維持戰(zhàn)斗力及作戰(zhàn)后快速恢復疲勞，是國內(nèi)外軍事醫(yī)學尤其是軍事作業(yè)醫(yī)學研究的重點課題之一。益氣滋陰、補精養(yǎng)神是對抗疲勞和快速恢復疲勞的有效手段。杞藿飲由刺五加、枸杞、淫羊藿、馬齒莧、紅景天、當歸、肉蓯蓉等藥物配伍而成，具有益氣滋陰、補精養(yǎng)神等功效［1］。本實驗觀察杞藿飲對力竭游泳大鼠肝細胞衰老及其超微結構損傷的保護作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)杞藿飲，由中國中醫(yī)科學院研制的杞藿速釋片改良而成，由刺五加、枸杞、淫羊藿、馬齒莧、紅景天、肉蓯蓉等組成，由濟南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院中醫(yī)科煎制和濃縮，制成杞藿飲原汁、75%稀釋和1.5倍濃縮3種煎劑備用。(2)大鼠血清一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate amino transferase，AST)試劑盒，均購自南京建成科技有限公司;肝細胞H2A磷酸化染色試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品，超微結構觀察使用日立H-7650分析透射電鏡。

1.2 動物及分組 清潔級SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量(170±10)g，由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按數(shù)字表法隨機分為4組，每組12只，分別為:游泳對照組，蒸餾水灌胃;杞藿飲高(1.5倍濃縮液)、中(原液)、低(75%稀釋液)3個濃度實驗組，按15 ml/kg體質(zhì)量給予相應濃度杞藿飲煎劑灌胃，每日2次，其間大鼠自由飲水。力竭游泳實驗在100cm×60cm×60cm的塑料泳槽桶中進行，水深50cm，水溫(31±1)℃。大鼠力竭運動疲勞按Thomas報道的標準進行判斷:大鼠沉入水中10 s不能自主上水面，且放在平面上無法完成翻正反射。實驗為期3周。

1.3 指標檢測與評價 (1)標本收集。實驗第22天，從各組大鼠腹主動脈取血后，迅速解剖取肝臟組織，用冰冷的生理鹽水沖凈血漬，放入凍存管后置于液氮罐中保存待測。(2)血清NO、ALT和AST活性測定。所取主動脈血不加抗凝劑收集，3000×g離心20 min，吸取上清液，全自動生化分析儀檢測NO、ALT和AST活性。(3)肝臟細胞H2A磷酸化染色。采用ABC染色法，按試劑盒方法操作，計數(shù)5個高倍鏡視野下肝臟組織中H2A陽性細胞數(shù)目，取平均值作為該標本肝細胞衰老指數(shù)，用以評價肝細胞衰老的狀況。(4)肝臟超微結構觀察。肝臟標本經(jīng)鋨酸、梯度脫水、樹脂包埋固化、超薄(70 nm)切片，再經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間差異用方差分析，P＜0.05為有差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對肝臟生化指標的影響 實驗第22天，高、中、低濃度杞藿飲組大鼠血清NO、ALT、AST與游泳對照組比較均明顯降低(P＜0.05)，高、中濃度杞藿飲組大鼠血清NO、ALT、AST與低濃度組比較降低更明顯(P＜0.05)。提示，杞藿飲對力竭游泳所致大鼠肝臟損害具有保護作用，且與濃度呈正相關。見表1。

表1 各組大鼠血清NO、ALT和AST活性比較(±s)

表1 各組大鼠血清NO、ALT和AST活性比較(±s)

注:NO為血清-氧化氮;ALT為丙氨酸氨基轉移酶;AST為天門冬氨酸氨基轉移酶。與游泳對照組比較aP＜0.05;與低濃度杞藿飲組比較bP＜0.05

組別 動物數(shù) NO(mmol/L) ALT(U/L) AST(U/L)游泳對照組12 68.20±11.23 218.01±43.77 793.80±63.44低濃度杞藿飲組 12 54.03±10.74a 149.82±32.73a 582.18±49.37a中濃度杞藿飲組 12 47.61±9.94ab 118.31±27.92ab484.11±63.39ab高濃度杞藿飲組 12 46.85±12.34ab121.81±26.66ab430.41±42.89ab

2.2 對肝細胞衰老的影響 肝臟衰老細胞磷酸化染色呈棕褐色，見圖1。計數(shù)各組每只大鼠各3個高倍(200倍)鏡視野下每100個肝細胞中陽性細胞數(shù)，取平均值為衰老指數(shù)。低、中、高濃度杞藿飲組的衰老指數(shù)分別為7.99±0.55、7.33±0.49、6.85±0.74，與游泳對照組(10.05±1.09)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。3個杞藿飲組肝細胞H2A磷酸化陽性細胞均明顯少于游泳對照組(P＜0.05)，提示杞藿飲可以降低肝臟細胞衰老程度。

圖1 各組大鼠衰老肝細胞H2A染色結果(×200)

2.3 對肝細胞超微結構的影響 電鏡下可見，游泳對照組大鼠肝細胞基質(zhì)松散，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂，線粒體腫脹伴萎縮，出現(xiàn)嵴斷裂、消失、空泡樣變;3個杞藿飲組大鼠肝細胞病變較輕，線粒體基本正常，呈橢圓形，未見嵴斷裂，無空泡樣變。見圖2。提示杞藿飲可以降低疲勞大鼠肝細胞損傷程度。

圖2 各組大鼠肝細胞電鏡下超微結構(×25 000)

3 討論

中醫(yī)理論認為，持續(xù)疲勞主要耗氣傷陰，睡眠剝奪主要耗精傷神。因此，益氣滋陰、補精養(yǎng)神應該是修復疲勞的有效手段。應用淫羊藿、人參、黃芪、紅景天、刺五加、枸杞子、五味子等益氣養(yǎng)陰、益精寧神的中藥修復疲勞是可行的。杞藿飲以益氣養(yǎng)陰、益精寧神等多味藥物組成，以淫羊藿和枸杞為主要配方。目前研究已證明淫羊藿具有抗應激、抗疲勞等作用，可促使患者術后白蛋白、轉鐵蛋白水平的恢復，減少術后的疲勞程度，且能增強機體的免疫功能［2-3］。枸杞具有增強和調(diào)節(jié)免疫功能、增強造血功能、抗腫瘤等作用［4-5］。這些藥物合用對抗疲勞有明顯的功效。

肝臟是人體最大的腺體，肝臟與運動的關系極為密切，運動時血液的重新分布會導致肝臟等內(nèi)臟器官血供減少，運動時能源物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的堆積等也都會從不同方面影響肝臟組織的結構和功能［6-7］。本研究觀察到，力竭游泳大鼠伴有明顯的肝臟損傷，表現(xiàn)為NO、ALT、AST等酶譜的改變，電鏡下線粒體損傷，給予杞藿飲可以減輕肝臟的損傷程度，肝酶譜明顯降低。由此認為，杞藿飲對預防疲勞所致的肝臟損傷及對疲勞的快速恢復起重要作用。

細胞衰老是細胞生命活動的客觀規(guī)律［8］。細胞凋亡通常作為評定運動性疲勞與恢復的可行性指標，一般認為程序性細胞衰老凋亡是一種利他性、生理性細胞死亡，即局部、個別的死亡有利于整體或種群的存活［9］。與以往研究觀察疲勞動物的肝細胞凋亡不同，本研究重點觀察肝細胞的衰老狀態(tài)，通過觀察細胞衰老指數(shù)，判斷疲勞對肝臟的損傷程度，進一步觀察到抗疲勞制劑杞藿飲能夠有效降低肝細胞的衰老，進而減少細胞的凋亡，保護肝臟功能，達到緩解運動性疲勞的效果。

［1］阿古拉，李東濤，李富玉.杞藿速釋片提取工藝的研究［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2009，16(6):113-114.

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［3］吳麗霞，吳鐵松，何文平，等.肉蓯蓉與淫羊藿提取物對小鼠抗疲勞作用研究［J］.國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報，2012，18(18):2665-2667.

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