反膠束萃取阿魏酸酯酶

王鎮發，陳培欽，鄧秩韜，謝晨，李夏蘭

（華僑大學 化工學院，福建 廈門361021）

阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）是羧酸酯水解酶的一個亞類，屬胞外酶，其主要生物功能是水解多糖與阿魏酸連結的酯鍵［1］.1987年，Mackenzie等［2］首次在橄欖色鏈霉菌中發現了阿魏酸酯酶；1991年，Faulds等［3］成功分離純化了阿魏酸酯酶.到目前，已從真菌和細菌中得到超過40種阿魏酸酯酶［4-6］，各種微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、肽鏈的結構、物化性質和催化特性上有所不同［4-7］.阿魏酸酯酶的分離純化是其應用的基礎，所以阿魏酸酯酶的分離純化一直都是研究的一個重點.相比于層析法，反膠束萃取蛋白質具有成本低、回收率高、操作時間短和處理量大等優點.本實驗室已從腐爛的木質纖維中篩選到1株產阿魏酸酯酶的菌株，并對其進行了鑒定［8］.本文研究反膠束萃取法分離純化該菌種發酵所產的阿魏酸酯酶，為阿魏酸酯酶的應用提供前期的基礎.

1 實驗材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

反式阿魏酸標準品，美國Sigma公司；阿魏酸甲酯，華僑大學化工學院曾慶友老師合成；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），分析純，北京佰利申科貿有限公司；異辛烷，正己醇，甲醇，氯化鉀等均為市售，分析純.

DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Thermo EC120小型垂直電泳系統，美國Thermo公司；ODS-C18型色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm），美國Thermo公司；MW3500型透析袋，上海綠鳥科技發展有限公司；XW-80A型漩渦混合儀，上海精科實業有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液的制備 菌種及發酵液的制備，參見文獻［9］.

1.2.2 阿魏酸及阿魏酸酯酶酶活的測定 阿魏酸的測定采用HPLC法［8］.阿魏酸酯酶活測定方法參見文獻［9］.

1.2.3 蛋白質濃度測定 蛋白質濃度的測定采用考馬斯亮藍法［10］.

1.2.4 反膠束萃取阿魏酸酯酶 1）萃取.用1 mol·L-1HCl溶液、1 mol·L-1NaOH溶液調節酶液p H值，用KCl調節酶液的離子強度.稱取一定質量的CTAB加入小試管中，再加入2 m L體積比為1：5的正己醇／異辛烷溶液，振蕩片刻，加入等體積的酶液，漩渦振蕩2 min，室溫靜置；待分層后測定下層水相的酶活力和蛋白濃度，計算萃取率（E）和純化倍數（D）.2）反萃取.在另一只小試管中加入1.5 m L萃取相，再加入等體積一定p H值和濃度的KCl溶液，漩渦振蕩2 min，室溫靜置；待油水分層后測定下層水相中的酶活力和蛋白濃度，計算總萃取率（Et）和純化倍數.

1.2.5 電泳 將經反膠束萃取和反萃取的的酶液進行SDS-PAGE電泳.

2 結果與討論

2.1 p H值對萃取率的影響

在KCl濃度為0.01 mol·L-1時萃取阿魏酸酯酶，結果如圖1所示.從圖1可知：萃取液p H值為12時，萃取率最高，達到94.5%.p H值主要決定蛋白質所帶的靜電荷，進而改變蛋白質表面電荷和反膠束內表面電荷間的靜電作用［11］.CTAB是陽離子表面活性劑，極性頭帶正電.因此，只有在水相p H值大于蛋白質等電點時，蛋白質帶負電荷，才能被包裹進反膠束中.該菌分泌的阿魏酸酯酶的pI值還未測定，但據報道，不同菌株來源的阿魏酸酯酶的pI值在3～10之間［12］.所以p H值越大，水相p H值和蛋白質等電點的差值越大，靜電作用就越強，萃取率就越高.

2.2 KCl濃度對萃取率的影響

在p H值為12時萃取阿魏酸酯酶，結果如圖2所示.從圖2可知：隨著離子濃度的增高，萃取率迅速降低，KCl濃度為0.5 mol·L-1時，萃取率只有15%.這可用雙電子層理論［11］解釋，即離子強度的增加減弱了表面活性劑極性頭之間的斥力，反膠束體積變小，蛋白質甚至無法進入反膠束.

圖1 p H值對萃取率的影響Fig.1 Effect of p H value on extraction efficiency

圖2 KCl濃度對萃取率的影響Fig.2 Effect of concentration of KCl on extraction efficiency

2.3 CTAB濃度對萃取率的影響

在p H值為12，KCl濃度為0時萃取阿魏酸酯酶，結果如圖3所示.從圖3可知：當CTAB濃度小于25 mmol·L-1時，萃取率隨著CTAB濃度的增加而提高.這是因為表面活性劑濃度的增加使反膠束的數量增加，萃取率提高.當CTAB濃度達到25 mmol·L-1時，水相中的阿魏酸酯酶全部進入反膠束中，萃取率接近100%.

2.4 反萃取時水相p H值對反萃取的影響

圖3 CTAB濃度對萃取率的影響Fig.3 Effect of concentration of CTAB on extraction efficiency

優化條件下（p H值為12，CTAB濃度為25 mmol·L-1，KCl濃度為0）對阿魏酸酯酶進行萃取后，在0和0.15 mol·L-1的KCl溶液中進行反萃取阿魏酸酯酶，結果如圖4所示.從圖4可知：當KCl濃度為0.15 mol·L-1，p H值為5～10時，其反萃取率為70%左右；而當p H＞8時，反萃取率下降.若KCl濃度為0時，改變水相的p H值，即使當水相p H值低于阿魏酸酯酶的pI值時，阿魏酸酯酶帶正電荷與CTAB的極性頭所帶的正電荷排斥，也無法實現阿魏酸酯酶從反膠束中的反萃取.這說明在萃取中起作用的不只是靜電作用，還有其他的因素，如疏水相互作用［11］、立體相互作用和特異性相互作用［12］.

2.5 反萃取時水相的KCl濃度對反萃取的影響

用p H值為7的不同濃度KCl溶液進行反萃取阿魏酸酯酶，結果如圖5所示.從圖5可知：隨著KCl濃度的升高，反萃取率逐漸增大，當KCl濃度為0.20 mol·L-1時，反萃取率最高為79%.當離子強度增大時，反膠束表面雙電層變?。?3］，阿魏酸酯酶與反膠束表面之間的靜電吸引減弱，酶在反膠束中的溶解度降低，從而使反萃取率提高.但進一步提高KCl濃度，反萃取率開始下降，當KCl濃度為0.25 mol·L-1時，萃取率僅為56%.這可能是較高的KCl濃度會導致酶的鹽析，從而使反萃取率降低.

圖4 反萃取水相的p H值對總萃取率的影響Fig.4 Effect of p H in backward aqueous phase on the total extraction efficiency

圖5 反萃取水相KCl濃度對總萃取率的影響Fig.5 Effect of concentration of KCl in backward aqueous phase on the total extraction efficiency

透析后粗酶液在p H值為12，CTAB濃度為25 mmol·m L-1，KCl濃度為0下萃取，在0.2 mol·L-1KCl下反萃取，酶活力（z）和蛋白濃度（c（蛋白質））的變化如表1所示.通過萃取和反萃取，阿魏酸酯酶回收率（Et）為79.0%，比活（Δz）從51.7μkat·g-1提高到356.7μkat·g-1，純化倍數（D）為6.9.

表1 阿魏酸酯酶純化的各參數Tab.1 Summary of the purification of feruloyl esterases

2.6 反膠束純化結果電泳

圖6為不同透析時間的阿魏酸酯酶液反膠束萃取純化后的SDS-PAGE電泳圖.其中：1為Marker；2為發酵液；3為經反膠束萃取及反萃取的純化結果.從圖6中可知：在條帶35 ku左右有一條帶，與本實驗室報導的相近［9］，為阿魏酸酯酶的條帶.同時還可以看出：CTAB反膠束純化阿魏酸酯酶有較好的效果，尤其是對除去分子量大于阿魏酸酯酶的蛋白質.

3 結論

圖6 阿魏酸酯酶液反膠束萃取后的電泳圖Fig.6 Electrophoresis of feruloyl esterase after reverse micelles extraction

研究結果表明：萃取時，透析后的粗酶液的p H值為12時，與等體積的25 mmol·L-1CTAB反膠束溶液混合，阿魏酸酯酶萃取率最高，接近100%；反萃取時，將反膠束與等體積p H值為7的0.20 mol·L-1KCl溶液混合，漩渦振蕩3 min，阿魏酸酯酶總得率最高為79%，比活從粗酶液的51.7μkat·g-1提高到356.7μkat·g-1，純化倍數為6.9.阿魏酸酯酶酶液經反膠束萃取后，SDS-PAGE電泳只顯示兩條帶，說明CTAB／正己醇／異辛烷反膠束體系能有效地分離純化阿魏酸酯酶.此方法與層析法相比，具有提取時間短、成本低、易于放大等優點.

［1］ CREPIN V，FAULDS C，CONNERTON I.Functional classification of the microbial feruloyl esterases［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，63（6）：647-652.

［2］ MACKENZIE C R，BILOUS D，SCHNEIDER H，et al.Induction of cellulolytic and xylanolytic enzyme systems inStreptomycesspp.［J］.Applied and Environmenta Microbiology，1987，53（12）：2835-2839.

［3］ FAULDS C B，WILLIAMSON G.The purification and characterization of 4-hydroxy-3-methoxycinnamic（ferulic）acid esterase fromStreptomycesolivochromogenes［J］.Microbiology，1991，137（10）：2339-2345.

［4］ TOPAKAS E，VAFIADI C，CHRISTAKOPOULOS P.Microbial production，characterization and applications of feruloyl esterases［J］.Process Biochemistry，2007，42（4）：497-509.

［5］ BENOIT I，DANCHIN E G J，BLEICHRODT R J，et al.Biotechnological applications and potential of fungal feruloyl esterases based on prevalence，classification and biochemical diversity［J］.Biotechnology Letters，2008，30（3）：387-396.

［6］ KOSEKI T，FUSHINOBU S，SHIRAKAWA H，et al.Occurrence，properties，and applications of feruloyl esterases［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84（5）：803-810.

［7］ FAZARY A E，JU Y H.Feruloyl esterases as biotechnological tools：Current and future perspectives［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2007，39（11）：811-828.

［8］ 李夏蘭，胡雪松，范韻敏，等.一株產阿魏酸酯酶青霉菌株的篩選、鑒定及生長特征［J］.微生物學通報，2010，37（11）：1588-1593.

［9］ 李夏蘭，范韻敏，方柏山.來自桔青霉的阿魏酸酯酶的分離純化、理化性質［J］.微生物學報，2010，50（8）：1058-1064.

［10］ 汪家正，范明.蛋白質技術手冊［M］.北京：科學出版社，2000：42-47.

［11］ 王金枝，曹學君.反膠束萃取技術分離胰激肽原酶［J］.中國生物工程雜志，2007，27（3）：93-99.

［12］ KOSEKI T，FUSHINOBU S，SHIRAKAWA H，et al.Occurrence，properties and applications of feruloyl esterases［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84（5）：803-810.

［13］ 李凱，李成付，李加友，等.反膠束萃取精氨酸脫亞胺酶［J］.精細化工，2008，25（2）：163-166.