利用西瓜種子檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒

肖璐,李玲,唐炎英,戴思慧,王軍輝,劉澤發,孫小武

(1.湖南農業大學園藝園林學院,長沙,410128；2.湖南省瓜類研究所；3.湖南人文科技學院)

利用西瓜種子檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒

肖璐1,李玲1,唐炎英1,戴思慧1,王軍輝2,劉澤發3,孫小武1

(1.湖南農業大學園藝園林學院,長沙,410128；2.湖南省瓜類研究所；3.湖南人文科技學院)

以疑似感染黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的西瓜植株上收取的種子為材料,提取總RNA為模板進行RT-PCR擴增,并對電泳后的目標條帶進行回收測序,將測序結果提交genebank與已知序列比較,結果顯示所擴增序列為CGMMV外殼蛋白（CP）基因中的一個片段,說明此方法可以成功檢測出西瓜種子攜帶的CGMMV,可作為一種快速檢測西瓜種子是否攜帶CGMMV的方法。

西瓜種子；黃瓜綠斑駁花葉病毒；RT-PCR

中國是世界西甜瓜第一生產大國,西甜瓜播種面積每年約230萬hm2,主產區遍布全國20多個省、自治區、直轄市[1]。并且自20世紀80年代中期以來,西甜瓜生產一直是我國許多地方農民經濟收入增加的重要來源。CGMMV是煙草花葉病毒屬葫蘆科植物的重要病毒之一,對葫蘆科作物生產造成嚴重威脅[2～5]。2006年我國農業部(農業部公告第788號)已將該病毒確定為全國農業植物檢疫性有害生物。由于種子帶毒是CGMMV傳播的主要途徑,而種子是農業生產中不可替代的生產資料。因此,加強西甜瓜種子的安全生產,建立健全種子病毒檢測方法,杜絕帶毒劣質種子上市,從源頭控制CGMMV的擴散蔓延有重要意義。CGMMV的檢測方法有多種且均較為成熟,各有各的優點,但以西瓜種子為檢測材料還未見報道。本研究以從感染CGMMV的西瓜植株上采集的種子為試驗材料,并應用優化的RT-PCR進行檢測鑒定,最終能夠擴增出與目標片段大小一致的條帶,將目標條帶進行回收測序,測序結果顯示擴增出的片段是CGMMV外殼蛋白(CP)基因的一段序列。本試驗為種子生產企業在CGMMV的診斷與快速檢測提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料的獲得

于2012年6月在山東發現疑似感染CGMMV的西瓜植株,待果實成熟后采集該植株果實并取種用于CGMMV的檢測。

1.2 試劑

大腸桿菌DH 5a為本實驗室保存、TRIZOL購自邁科為公司、Pmd18-T、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4DNA連接酶、D2000 DNA Maker等購自天根公司；膠回收試劑盒購自OMEGA公司；M-mLV逆轉錄酶購自Invitrogen公司；瓊脂糖為BIO-WEST公司生產；其余試劑為國產分析純。

1.3 引物

RT-PCR使用白靜等[6]設計的可成功檢測南瓜果實CGMMV的引物,上游引物CGMMV-cpf: 5'-ATGGC'VFACAATCCGATCAC-3',下游引物CGMMV-cpr:5'-CTAAGCTVFCGAGGTGGTAGC-3',預期目標片段493 bp。

1.4 葉片與種子總RNA提取及RT-PCR

取西瓜種子一粒或葉片0.5 g置于研缽內,加液氮研磨成粉,按TRIZOL法提取總RNA。方法如下:液氮研磨西瓜種子或葉片至勻漿,加1 mL Trizol,移入1.5 mL離心管中,加500 μL氯仿異戊醇劇烈震蕩15 s冰浴10 min,室溫12 000 r/min離心15 min；取上清液入新離心管,加等體積氯仿異戊醇混勻,重復2次；取上清液入新離心管,加500 μL異丙醇,輕微混勻,室溫放置10 min,12 000 r/min離心10 min(4℃)；棄上清液,加入1 mL 80%乙醇(用DEPC水配制),混勻,室溫7 500 r/min離心5 min；棄上清液,1 mL無水乙醇洗滌,7 500 r/min離心5 min(4℃)；棄上清液,風干,加30～50 μL無菌水完全溶解。

反轉錄體系:體系(20 μL),模板RNA 2 μL,下游引物CGMMV-cpr(10 mmol/L)2 μL,RNase-Free H2O 9 μL,70℃變性10 min,冰上放置5 min,再依次加入5×buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTP 2 μL,M-mLV反轉錄酶1 μL,42℃恒溫1 h,70℃5 min。

PCR擴增體系:取2 μL cDNA作為模板,10×buffer(含Mg2+) 3 μL,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL, DNA聚合酶0.5 μL,加無菌水14.5 μL,總體積為25 μL,擴增條件為95℃變性3 min；95℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環30次；72℃,10 min；4℃保存。反應結束后對PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統檢測拍照。

1.5 檢測結果的確定

為進一步確定擴增條帶是否為黃瓜綠斑駁花葉病毒CP基因某一片斷,將PCR目的電泳條帶進行回收,操作過程參照試劑盒說明書。回收的PCR產物與PMD18-T連接,連接產物轉化大腸桿菌,用Amp抗性培養基法進行藍白斑篩選,陽性克隆經菌落PCR確認后將菌液送交上海生工測序,對測定的序列提交genebank進行blast比較。

2 結果與分析

2.1 疑似感病植株癥狀觀察

疑似感病植株種植于大棚內,整個大棚內的植株均有相同癥狀發生(圖1)。其癥狀表現為:全株性或系統性特征,葉片產生輕微的淺黃色斑紋,果實成熟后剖開觀察病果呈暗花紅色水瓤樣。與其他沒有癥狀大棚的植株比較,疑似感病植株明顯較矮。

圖1 疑似感病植株的葉片與果實

2.2 材料帶毒檢測及確定

從疑似感毒植株收獲100粒種子進行RTPCR病毒檢測,以沒有感病癥狀的西瓜植株采集的種子作陰性對照。檢測結果顯示,疑似感病西瓜種子均能擴增出接近500 bp大小的目標條帶,而陰性對照沒有擴增出條帶(圖2)。隨機選取10個陽性進行目標條帶回收及測序,將測序結果提交genebank進行blast比較。結果表明,隨機選取的10個樣品的目標條帶測序結果相同且為黃瓜綠斑駁花葉病毒CP基因中的一個片段,因此可以確定RT-PCR可成功檢測西瓜種子是否帶毒。

3 結論與討論

CGMMV是種傳病毒且極易通過汁液摩擦、葉片接觸、嫁接、農事操作等非介體傳播[7],因此加強種子檢驗檢疫規程制定和監管,杜絕一切帶毒種子出現在田間是防止CGMMV擴散的第一道屏障。

圖2 RT-PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳

本文研究了利用RT-PCR方法檢測疑似感染CGMMV植株的種子帶毒情況,在有限樣本量的情況下檢測種子帶毒率為100%。為進一步驗證此方法的準確性和實用性,應增加檢測的樣本量及確定能檢測出單粒種子帶毒的最大種子量。相比較其他檢測方式,無論是從經濟效益還是準確可靠性考慮,RT-PCR檢測方法所具有的檢測靈敏度高、簡便快速及花費少等優點都使其在對CGMMV的檢驗檢疫中具有較大的應用價值。因此,規范及標準化整個檢測流程,對種子生產企業的種子安全生產具有極大的意義。

[1]孫小武,馬躍.進一步加強品種及種子管理,確保西瓜甜瓜生產安全[J].中國瓜菜,2011,24(1):58-59.

[2]陳紅運,趙文軍,程毅,等.遼中地區西瓜花葉病病原的分子鑒定[J].植物病理學報,2006,36(4):306-309.

[3]周玲玲,吳元華,趙秀香,等.黃瓜綠斑駁花葉病毒生物學特性及對西瓜生長的影響[J].沈陽農業大學學報,2008, 39(4):417-422.

[4]Lee K Y,Lee B C,Park H C.Occurrence of cucumber green mottle mosaic virus disease of watermelon in Korea [J].Korea J Plant Pathol,1990,6:250-255.

[5]Park J W,Cheon J U,Choi H S.Occurrence and control of seed-borne plant viruses in Korea[C]//Crop Prot Res Rural Development Administration,2001:194-218.

[6]白靜.黃瓜綠斑駁花葉病毒、番茄環斑病毒及南方菜豆花葉病毒的分子檢測技術研究[D].沈陽:沈陽農業大學, 2007.

[7]張永江.黃瓜綠斑駁花葉病毒研究進展[J].河南農業科學, 2006(8):9-12.

Utilizing Watermelon Seeds for Detection of Cucumber Green Mottle Mosaic Virus

In the paper,we took the seeds harvesting from watermelons which were suspected of being infected with cucumber green mottle mosaic virus(CGMMV)as material,and extracted total RNA for RT-PCR amplification,then we recycled and sequenced the target bands,and submitted the sequencing results to genebank.The results showed that the amplified sequence was a fragment of the CGMMV coat protein(cp)gene,which indicated that the method used in the test could successfully detect whether the watermelon seeds carrying CGMMV or not,and the method was a rapid method of detecting CGMMV of watermelon seeds.

Watermelon seeds；Cucumber green mottle mosaic virus；RT-PCR

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.02.028

西甜瓜現代農業產業體系,湖南省教育廳項目（11C0708）

肖璐（1988-）,男,在讀碩士研究生,研究方向蔬菜學,電話:13677369121,E-mail:spellboss@163.com

孫小武,男,通信作者,博士生導師, E-mail:sunxiaowu2007@126.com

2012-10-24