高效液相色譜分離與分析胡麻卵磷脂中磷脂酰膽堿

關(guān) 明，侯俊峰，古再麗努爾·阿爾肯，艾散江·艾海提

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，污染監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054)

高效液相色譜分離與分析胡麻卵磷脂中磷脂酰膽堿

關(guān) 明，侯俊峰，古再麗努爾·阿爾肯，艾散江·艾海提

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，污染監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054)

目的：建立胡麻卵磷脂樣品中磷脂酰膽堿的高效液相色譜分離分析方法。方法：采用Platisil C18色譜柱(150mm×4.6mm，5?m)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，流動(dòng)相為乙腈-甲醇(50:50，V/V)，流速為1mL/min，以磷脂酰膽堿峰面積定量。結(jié)果：胡麻卵磷脂樣品中磷脂酰膽堿的含量為73.6%，平均回收率為103.3%，精密度(RSD)為0.28%，檢出限為0.25?g。結(jié)論：建立的方法準(zhǔn)確、高效，結(jié)果真實(shí)可靠。

高效液相色譜法；磷脂酰膽堿；胡麻卵磷脂

胡麻(Linum usitatissimum L.)是世界上僅次于大豆、油菜、向日葵和花生的油料作物[1]。在我國(guó)，胡麻主要分布在山西、內(nèi)蒙古、河北、甘肅、寧夏和新疆等省(區(qū))[2]。新疆地區(qū)在生產(chǎn)胡麻植物油的同時(shí)也生產(chǎn)出了胡麻油腳等副產(chǎn)品，油腳是生產(chǎn)卵磷脂的主要原料，但常被丟棄浪費(fèi)，有待深度開發(fā)與利用。卵磷脂是一種混合物，包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酸(PA)等成分[3]，也是一種天然表面活性劑，在食品、藥品、油脂加工等領(lǐng)域有廣泛的用途，市場(chǎng)前景廣闊[4]。磷脂酰膽堿是卵磷脂的主要成分，能增強(qiáng)嬰兒智力，提高學(xué)習(xí)效率，尤其是胎兒，在生長(zhǎng)發(fā)育中對(duì)磷脂酰膽堿的需求極大[5]。以高純度藥用大豆磷脂研制的抗癌新藥139針劑，目前在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)供不應(yīng)求[6]。

目前，卵磷脂的分析方法有紫外-可見吸收光譜分析法[7-9]、柱層析法[10]、核磁共振光譜分析法[11]、薄層色譜法[12-14]、氧彈燃燒-灰化分光光度法[15]、高效毛細(xì)管電泳法[16]、高效液相色譜法[3,5,17-20]、微波消解-可見分光光度法[21]等，其中，常用高效液相色譜法對(duì)卵磷脂樣品中的磷脂酰膽堿進(jìn)行分離分析，但在報(bào)道的色譜條件下，流動(dòng)相成本相對(duì)較大，磷脂酰膽堿出峰較慢，分離效率與分離效果有待改善。

本實(shí)驗(yàn)以課題組從胡麻油腳原料中精制得到的胡麻卵磷脂為研究對(duì)象，擬利用高效液相色譜法，考察檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相配比對(duì)分離效果的影響，對(duì)胡麻卵磷脂樣品中的磷脂酰膽堿進(jìn)行分離分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純) 美國(guó)Fisher公司；胡麻卵磷脂樣品 本課題組精制；磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品(P3556，純度≥99%) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-1100高效液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)安捷倫公司；TU-1800雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Platisil柱(150mm×4.6mm，5?m)；流動(dòng)相：乙腈-甲醇(50:50，V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)215nm；流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10?L；柱溫25℃；以峰面積定量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品0.0052g，采用色譜純甲醇溶解于5mL容量瓶中，制得質(zhì)量濃度為1.04mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻置于冰箱冷藏待用。

1.3.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取卵磷脂樣品0.1357g溶解于25mL容量瓶中，制得質(zhì)量濃度為5.428mg/mL的溶液，取2mL稀釋至10mL容量瓶中，制得質(zhì)量濃度為1.087mg/mL的樣品溶液，搖勻置于冰箱待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

紫外掃描表明，標(biāo)準(zhǔn)品溶液在207、228、271nm的波長(zhǎng)處有較大吸收，207nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但考慮到溶劑甲醇在207nm波長(zhǎng)處也有較大的吸收，為了減小基線噪音，選擇207、215、228、271nm 4個(gè)波長(zhǎng)分別進(jìn)行了色譜分離，如圖1所示。

圖1 不同檢測(cè)波長(zhǎng)處標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜分離情況Fig.1 Chromatographic separation of standard solution at different detection wavelengths

圖1 表明，不同檢測(cè)波長(zhǎng)處標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜分離情況均良好。但是，207nm波長(zhǎng)處溶劑甲醇也有較大吸收，會(huì)導(dǎo)致基線噪音很大，且雜質(zhì)峰較多；而271nm波長(zhǎng)處響應(yīng)信號(hào)過小，不利于定量分析；215、228nm波長(zhǎng)處，色譜圖中雜質(zhì)峰明顯減少，且可以避免溶劑甲醇的吸收干擾，相對(duì)于228nm波長(zhǎng)而言，215nm與最大吸收波長(zhǎng)207nm最為接近，最終，選定215nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相配比的選擇

為了進(jìn)一步優(yōu)化分離效果，獲得最佳色譜條件，建立適于卵磷脂中磷脂酰膽堿的色譜分離分析系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)最佳分離和準(zhǔn)確定量，考察不同配比流動(dòng)相的分離情況，并進(jìn)行了分離效果對(duì)比，如圖2所示。

圖2 不同配比流動(dòng)相下供試品溶液色譜分離情況Fig.2 Chromatographic separation of sample using different mobile phases

圖2 表明，甲醇-水為流動(dòng)相的分離效果優(yōu)于單獨(dú)使用甲醇、乙腈為流動(dòng)相的分離效果；乙腈-甲醇為流動(dòng)相的分離效果優(yōu)于甲醇-水為流動(dòng)相的分離效果；乙腈-甲醇(30:70，V/V)為流動(dòng)相的分離效果較好，但PC峰與右側(cè)相鄰的小峰未能完全分離；乙腈-甲醇(50:50，V/V)為流動(dòng)相的分離效果最佳，磷脂酰膽堿峰的保留時(shí)間為4.812min，分離度大于2，滿足高效液相色譜的分離要求。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與檢出限

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照3、5、7、9、11μL不同進(jìn)樣量的方法，分別進(jìn)樣3次，以卵磷脂中磷脂酰膽堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，磷脂酰膽堿平均峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，在3.12～11.44μg范圍內(nèi)，磷脂酰膽堿的質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A=90.97ρ-0.8742，回歸系數(shù)r=0.9999。

取1.3.2節(jié)所制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至原質(zhì)量濃度的1/100，按1.3.1節(jié)色譜條件，測(cè)得磷脂酰膽堿的檢出限(RSN=3)為0.25μg，略大于文獻(xiàn)[19]報(bào)道的0.20μg。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5μL，分別測(cè)得峰面積，計(jì)算RSD。如表1所示。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 The results of precision experiments

結(jié)果表明，RSD為0.28%，精密度良好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 樣品測(cè)定

取供試品溶液進(jìn)樣，重復(fù)6次，每次10μL，分別測(cè)得峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得供試品中的磷脂酰膽堿的含量，已知樣品母液質(zhì)量濃度為5.43mg/mL，稀釋5倍的測(cè)量溶液質(zhì)量濃度為1.09mg/mL，計(jì)算出樣品磷脂酰膽堿的平均含量為73.6%，如表2所示。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Table2 The results of sample determination

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

采用加標(biāo)回收法，分別取200、160、120μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到200μL的供試品溶液中，進(jìn)樣，每次10μL，每組平行測(cè)定兩次，計(jì)算平均回收率及RSD值，如表3所示。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 The results of recovery experiments

表3表明，平均回收率為103.3%，RSD為1.40%，方法準(zhǔn)確，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

3 討 論

卵磷脂組分比較復(fù)雜，在檢測(cè)過程中影響因素較多，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)卵磷脂樣品中磷脂酰膽堿進(jìn)行了分離及含量測(cè)定，其分離效果好、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，為卵磷脂質(zhì)量分析與控制提供了借鑒和參考。流動(dòng)相極性與配比的不同對(duì)樣品的分離有著至關(guān)重要的作用，文獻(xiàn)[3,18-19]報(bào)道采用硅膠柱，正已烷-異丙醇-醋酸為流動(dòng)相，但磷脂酰膽堿的保留時(shí)間超過10min，分析時(shí)間增加；還有文獻(xiàn)[5]報(bào)道采用甲醇-1%磷酸(50:1，V/V)為流動(dòng)相，但磷脂酰膽堿的保留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)13min，且峰形對(duì)稱性稍差；與文獻(xiàn)報(bào)道比較，本實(shí)驗(yàn)采用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，磷脂酰膽堿出峰時(shí)間明顯縮短，保留時(shí)間減少一半以上，分析時(shí)間得以節(jié)省，分析效率得到提高；此外，通過添加乙腈使峰形突顯，達(dá)到了改善峰形的目的，同時(shí)也減少了色譜峰的拖尾現(xiàn)象，分離效果得到改善，但隨著乙腈比例的增大，磷脂酰膽堿的分析效率降低，且成本增加，最終，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-乙腈(50:50，V/V)為流動(dòng)相，有效地對(duì)胡麻卵磷脂樣品中的磷脂酰膽堿進(jìn)行了分離，達(dá)到了較為滿意的分離效果。

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Separation and Analysis of Phosphatidylcholine in Flax Lethin by HPLC

GUAN Ming，HOU Jun-feng，GUZAILINUER·Aerken，AISANJIANG·Aihaiti
(Key Laboratory of Pollution Monitoring and Control, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, ?rümqi 830054, China)

Objective: To establish an HPLC method for the separation and analysis of phosphatidylcholin in fl ax lecithin. Methods: A Platisil C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) was used for chromatographic separation using acetonitrilemethanol (50:50, V:V) as mobile phase at fl ow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 215 nm. Results: The content of phosphatidylcholin in fl ax lecithin was 73.6%, and the average spiked recovery rate was 103.3%. The precision RSD for 6 replicate determinations was 0.28%, and the detection limit was 0.25 μg. Conclusion: The method is accurate, eff i cient and can provide reliable results.

high performance liquid chromatography (HPLC)；phosphatidylcholine；f l ax lecithin

TS207.3

A

1002-6630(2013)18-0223-04

10.7506/spkx1002-6630-201318045

2012-09-25

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2011211A031)

關(guān)明(1974—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)橘Y源植物化學(xué)。E-mail：guanm@xjnu.edu.cn