酶聯免疫吸附結合熒光分析法測定乳粉加速貯藏過程中的褐變產物

劉 玲，楊雙華，紀淑娟，Leif Horsfelt SKIBSTED

(1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.哥本哈根大學生命學部食品系，哥本哈根 2200)

酶聯免疫吸附結合熒光分析法測定乳粉加速貯藏過程中的褐變產物

劉 玲1,2，楊雙華1，紀淑娟1，Leif Horsfelt SKIBSTED2

(1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.哥本哈根大學生命學部食品系，哥本哈根 2200)

在65℃封閉的加速貯藏條件下，對3種不同類型乳粉(全脂乳粉、脫脂乳粉和酪乳粉)的褐變產物——末端糖基化產物(AGEs)進行研究和檢測。在確立酶聯免疫吸附(ELISA)法測定末端糖基產物含量的基礎上，結合熒光分析測定乳粉中蛋白末端糖基化所產生的熒光物質。結果表明：AGEs產生的熒光物質和AGEs含量隨著貯藏時間的延長而增加。酶聯免疫吸附法采用初級抗體和酶標二抗稀釋倍數均為2500倍時可以有效測定褐變乳粉中AGEs含量，其中加速貯藏20d后乳粉中AGEs含量最高，可達到0.61ng/mL。最低檢出質量濃度達到0.006ng/mL，最大誤差率在5%左右，重復性良好。因此，乳粉褐變的熒光強度和AGEs含量的ELISA檢測可以作為評價乳粉質量的有效方法。

乳粉；非酶褐變；末端糖基化產物；酶聯免疫吸附法；熒光分析

乳粉是一種營養豐富的乳制品，由于其耐貯藏、食用方便，深受人們喜愛。自三聚氰胺事件之后，我國對于乳品安全的監管力度日益加強。乳粉在室溫貯存過程中會發生不同程度的化學變化，導致營養價值降低并可能產生有毒物質。其中最容易發生的反應之一就是由蛋白質、乳糖和脂質作用產生的非酶褐變反應[1-6]。褐變程度隨著貯藏時間的延長而加強，因此乳粉的質量也隨之不斷下降。褐變的最重要終產物之一是末端糖基化產物(advanced glycosylation end products，AGEs)，它是蛋白質在無酶條件下，自發地與單糖反應所產生的多種不同化學結構交聯的不穩定棕色有熒光特性的混合物[7]。目前，關于AGEs的研究主要集中在醫學方面，在糖尿病并發癥、動脈粥樣硬化、白內障、脊髓側索硬化癥等病變和衰老的發展中AGEs均有重要作用。AGEs在人體正常的新陳代謝過程中形成，隨著年齡的增加血液中的AGEs的含量也隨著增加[8-9]。在食品加工貯藏過程中，AGEs往往是因熱處理發生非酶褐變時形成，相關的研究正在引起食品研究工作者的關注[10-12]。因此，檢測人體內中及食品中的AGEs含量對多種疾病的預防都有重要的意義。AGEs具有多種不同存在形式，目前已知的結構形式包括戊糖苷素(pentosidine)、Versperlysine、羧乙基賴氨酸(CEL)、羧甲基賴氨酸(CML)、咪唑賴氨酸(imidazolysine)、Pyrraline及Crossline等[13-15]。

酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法是近30年發展起來的一種綜合性酶免疫化學分析方法，目前已廣泛應用于臨床醫學、生物學和分析化學等領域，但該方法在我國的食品領域的應用主要集中在農藥殘留、毒素檢測、病原微生物檢測等方面[16-17]，食品成分檢測應用較少，主要原因是食品自身體系較為復雜。從理論上分析，食品體系的一切物質都可直接或間接地作為抗原，因此可以應用ELISA分析方法。與傳統的成本高、耗時費力的高效液相色譜和氣相色譜等方法比較，ELISA分析具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高且廉價等優點。目前我國用于乳品中的ELISA檢測主要是測定乳中的免疫球蛋白、乳鐵蛋白、農殘和毒素，尚未見用于AGEs檢測的報道。本實驗利用ELISA方法檢測乳粉貯藏過程中產生的AGEs，并結合AGEs產生的熒光變化來確定乳粉發生非酶褐變的程度，以期為評定乳粉的質量提供一種簡單有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉于2010年9月28日丹麥Arla乳品公司生產車間采集，采集后取500g密封真空包裝，冷庫(－18℃)保存；使用時間為2011年11月。

牛血清白蛋白(BSA)、兔抗AGE多克隆抗體、HRP-羊抗兔IgG、明膠 美國Sigma-Aldrich公司；AGE 德國Biologo公司；TMB底物液 丹麥Kem-En-Tec公司；其他試劑均為分析純。

包被液：0.1mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6；稀釋液：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.4；洗滌液(PBST)：磷酸鹽緩沖液(PBS)＋0.05% Tween-20；封閉液：磷酸鹽緩沖液(PBS)＋0.5%明膠；終止液：0.3mol/L濃硫酸。

1.2 儀器與設備

電子分析天平 德國Sartorius公司；臺式離心機 丹麥Ole Dich公司；旋渦混勻器 意大利VELP Scientifica公司；LS5熒光光譜儀 美國Perkin Elmer公司；酶標檢測儀 瑞士Tecan公司；96孔酶標板 丹麥VWR公司；純凈水制備儀器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 乳粉的加速貯藏

為誘導乳粉盡快發生非酶褐變反應，將約10g鮮乳粉裝入20mL玻璃瓶并用鋁制蓋密封，放入65℃烘箱貯藏20d，每隔一段時間取出樣品3瓶進行平行測定。樣品有3種類型：全脂乳粉(whole milk powder，WMP)、脫脂乳粉(skimmed milk powder，SMP)和酪乳粉(butter milk pwder，BMP)。

1.3.2 乳粉褐變反應產物AGEs波長掃描分析

1.3.2.1 乳粉的前處理

準確稱取不同貯藏期的1.0mg乳粉定容至10mL純水中，用0.1mol/L鹽酸調整溶液至pH4.7，稀釋定容至100mL，室溫靜置30min，過濾樣液。

1.3.2.2 波長掃描分析條件

激發波長347nm；掃描范圍300～500nm；掃描速率200nm/min；λex為5.0nm；λem為5.0nm。

1.3.3 乳粉貯藏過程中AGEs含量的測定

1.3.3.1 乳粉樣品制備

準確稱取不同貯藏期的2.5mg乳粉定容至5mL磷酸緩沖液(pH9.6)中，渦旋混合器振蕩1h制備成混合液，3000r/min離心10min，留取上清液，得到待測樣品。

1.3.3.2 間接酶聯免疫吸附法測定

用包被液稀釋抗原，100μL/孔加入待測樣品或抗原(BSA-AGE或BSA)于酶標板中，4℃冰箱過夜。恢復至室溫傾去包被液，加入洗滌液PBST洗板3次，每次2min，洗滌之后將洗滌液除去，扣過來拍打至無殘留液滴出(扣干)。每孔加300μL封閉液，37℃保溫2h，再以PBST洗滌3次，扣干。加100μL/孔經過稀釋的初級抗體，于37℃孵育1h。用PBST洗板3次，扣干。再加入100μL/孔經過稀釋酶標二抗，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，扣干。加入TMB顯色液100μL/孔，37℃暗處反應15min，顯示藍色。最后每孔加100μL 0.3mol/L濃硫酸以終止反應，顏色變黃。比色檢測波長450nm處測定各孔吸光度。實驗重復3次。

1.3.3.3 標準曲線的建立

配制質量濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008ng/mL的BSA-AGE標準液，酶聯免疫測定方法同1.3.3.2節。以BSA-AGE標準液的質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 ELISA法測定AGEs含量的標準曲線

以BSA-AGE標準液的質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，得回歸方程：y＝5.511x＋1.148，R2＝0.994。

制備標準曲線時，標準BSA-AGE的含量確定是在實驗中選擇了3個不同的標準質量濃度，分別為50、5ng/mL和0.5ng/mL。結果表明，0.5ng/mL范圍的標準曲線線性最好。這是由于當標準溶液質量濃度過高時，蛋白質分子間相互作用力較大，因而影響載體對蛋白質的吸附，同時造成最終顯色過快，沒等全部加入顯色劑都已經反應完成，使得反應不均勻，結果不準確。在確定的標準曲線范圍內，對乳粉樣品進行稀釋實驗，得到合適的樣品質量濃度。

2.2 初抗和酶標二抗質量濃度范圍的確定

根據儀器的檢測范圍，抗原抗體反應吸光度在0.5～3.0左右最佳，故選擇吸光度在此范圍內的稀釋濃度作為工作范圍。初級抗體的稀釋倍數為1000～5000，乳粉抗原質量濃度為0.05～0.45ng/mL。酶標二抗按1:2000、1:4000、1:8000稀釋。3次平行實驗，取平均值，結果如表1所示。可知隨包被乳粉溶液抗原質量濃度升高，反應吸光度升高。比較不同的初抗和二抗稀釋度條件，初抗在1:1000～1:3000、酶標二抗在1:2000～1:4000的稀釋度條件下，吸光度比較理想，因此選擇稀釋度為初抗1:2500、酶標二抗1:2500，在此范圍的質量濃度作為工作范圍。

表1 初抗和酶標二抗最佳工作質量濃度的確定Table1 Selection of optimal concentration of antibody and HRP labeled goat anti-rabbit IgG

2.3 乳粉中AGEs的波長掃描圖譜分析

圖1 全脂乳粉AGEs物質波長掃描譜圖Fig.1 Scanning spectra of AGEs in whole milk powder stored for different days

從圖1可看出，隨著貯藏時間的延長，全脂乳粉的熒光強度呈增強趨勢。在415nm波長處，熒光強度從22.47上升到98.84。熒光強度的上升說明熒光物質的含量隨著乳粉貯藏時間的延長而提高。這些熒光物質當中，主要為美拉德反應的產物，也有部分脂質氧化產物和其他熒光物質[18-19]，熒光強度的增強說明美拉德反應主導物質AGEs大量累積。同時，隨著貯藏時間的延長，譜峰的位置低波長方向遷移，說明其熒光物質的結構逐漸發生細微變化，因為AGEs是一系列交聯聚合物質，隨著高溫貯藏時間的延長，美拉德反應生成的AGEs的結構會有一定變化。

2.4 3種乳粉AGEs熒光物質的對比分析

圖2 貯藏過程中3種乳粉熒光產物的熒光強度變化Fig.2 Changes in fluorescent intensity of three types of milk powder during accelerated storage

從圖2可以看出，3種乳粉的熒光強度都在貯藏過程中有比較明顯的增加。其中全脂乳粉(WMP)和脫脂乳粉(SMP)在65℃的貯藏條件下AGEs物質的生成速度基本一致，在前10d，脫脂乳粉略快于全脂乳粉，但10d之后全脂乳粉加速反應超越脫脂乳粉，最后兩者終產物的熒光強度基本持平。但是，酪乳粉(BMP)在貯藏過程中體現出特殊的反應速度，在貯藏之初就有一定的熒光物質，在20d的貯藏過程中AGEs熒光物質生成速度相對不高。最后酪乳粉的熒光強度與其他兩種乳粉基本接近，3種乳粉最終產生的熒光物質含量相當。酪乳粉的這種變化主要是因為其加工過程比較特殊，它是攪拌脫去黃油后干燥制得，蛋白質含量相對稍高，在脫黃油加工過程中可能部分成分已經開始反應形成熒光物質，而隨著蛋白質的變性，在貯藏過程中可以進一步生成AGEs熒光物質的成分就減少，最終反應產物沒有量的優勢。另一方面也說明，除了AGEs產生熒光物質之外，有其他熒光物質在此波長條件下存在，比如脂質氧化產生的終產物及乳糖所產生的熒光物質等[18-19]。由此可見，熒光分析可以用于評價貯藏終產物的增長趨勢，但是直接從熒光物質的測定來確定非酶褐變可能會存在一定的偏差，因此結合AGEs含量的測定來確定褐變程度更為準確。

2.5 乳粉中AGEs含量的測定

圖3 加速貯藏過程中3種乳粉AGEs含量的變化Fig.3 Changes in the contents of AGEs in three types of milk powder during accelerated storage

由圖3可知，3種乳粉在加速貯藏過程中，其AGEs含量均呈上升趨勢，新鮮乳粉中AGEs的含量經檢測為0.006ng/mL，接近0，加速貯藏20d后的AGEs含量上升至0.14～0.61ng/mL，其中全脂乳粉的AGEs生成量最大，反應速度最快，在16d時反應誤差較大，達到5%，其他階段反應誤差在1%～2%之間，重復性良好。在貯藏前5～10d，全脂乳粉中AGEs生成速度增長得很快，之后速度減慢，最后3天又大幅度增加，這一現象與感官檢測到的乳粉的顏色改變基本一致，說明在加速貯藏到一周之后，乳粉已經大比例發生非酶褐變的美拉德反應，多數蛋白質和乳糖、甚至部分脂質都參與了美拉德反應。這種主要成分的參與也改變了乳粉的營養價值。

3種乳粉中，全脂乳粉含有較高含量的脂肪(約26%)，脫脂乳粉和酪乳粉都含低于5%的脂肪；酪乳粉的蛋白質含量略高于全脂乳粉和脫脂乳粉，但差別不大。由圖3可知，全脂乳粉形成AGEs的速度最快，可見脂質的存在是形成AGEs的重要條件。脂質氧化和美拉德反應依附存在[20]，脂質的氧化加速了美拉德反應的速度，導致AGEs反應加速。而脂質氧化和美拉德反應造成食品營養成分的大量損失，在人體內則會誘發各種老年性疾病。因此，通過研究檢測AGEs的含量變化不僅可以應用在醫學領域中老年性疾病的鑒定，也可以應用于食品劣變的質量評價。

3 結 論

本研究通過建立ELISA方法鑒定美拉德褐變產物AGEs的含量，配合糖基化產物熒光物質的含量檢測來確定乳粉加速貯藏過程中非酶褐變物質的含量，從而確定乳粉化學劣變的程度。通過實驗，隨著貯藏時間延長褐變產物含量增加，乳粉劣變加速。采用ELISA方法鑒定AGEs的含量，具有特異性強、簡便、高效的優勢。在本實驗中，標準曲線的最低質量濃度取值0.008ng/mL，最低檢出質量濃度達到0.006ng/mL，誤差率在5%左右，重復性良好。采用ELISA方法可以同時做多個樣品，具有處理量大節約時間的優點。ELISA方法結合糖基化產物的熒光物質檢測鑒定AGEs含量，為乳粉貯藏過程中的劣變化學反應檢測提供了一種簡便準確的方法。

[1] MORGAN F, NOUZILLE C, BAECHLER R, et al. Lactose crystallisation and early Maillard reaction in skim milk powder and whey protein concentrates[J]. Dairy Science and Technology, 2005, 85(4/5): 315-323.

[2] GONZALES A, NARANJO G, LEICA G, et al. Maillard reaction kinetics in milk powder: effect of water activity at mild temperatures [J]. International Dairy Journal, 2010, 20(1): 40-45.

[3] THOMSEN M, LAURIDSON L, SKIBSTED L, et al. Temperature Effect on lactose crystallization, Maillard reactions, and lipid oxidation in whole milk powder[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53: 7082-7090.

[4] 馬志玲, 王延平, 吳京洪, 等. 乳及乳制品加工中的美拉德反應[J].中國乳品工業, 2002, 30(3): 8-10.

[5] 王惠英, 孫濤, 周冬香, 等. L-賴氨酸與D-核糖的模式美拉德反應及其產物抗氧化性能研究[J]. 食品科學, 2008, 29(5): 112-115.

[6] 張曦, 李琦, 景浩. 乳清蛋白-木糖美拉德反應產物的成膜性及其膜包裹對核桃仁脂質過氧化的抑制作用[J]. 食品科學, 2011, 32(5): 58-64.

[7] GOLDIN A, BECKMAN J, SCHMIDT A, et al. Advanced glycation end products[J]. Circulation, 2006, 114(5): 597-605.

[8] FREIDJA M, TARHOUNI K, TOUTAIN B, et al. The AGE-breaker ALT-711 restores high blood flow-dependent remodeling in mesenteric resistance arteries in a rat model of type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2012, 61(6): 1562-1572.

[9] WANG Lingjie, LU Lin, ZHANG Fengru, et al. Increased serum highmobility group box-1 and cleaved receptor for advanced glycation endproducts levels and decreased endogenous secretory receptor for advanced glycation endproducts levels in diabetic and non-diabetic patients with heart failure[J]. European Journal of Heart Failure, 2011, 13(4): 440-449.

[10] SHOICHI Y, SEIJIi U, SEIYA O. Food-derived advanced glycation end products (AGEs): a novel therapeutic target for various disorders[J]. Current Pharmaceutical Design, 2007, 13(5): 2832-2836.

[11] GOLDBERG T, CAI Weijing, PEPPA M, et al. Advanced glycoxidation end products in commonly consumed foods[J]. Journal of the American Dietetic Association, 2004, 104(8): 1287-1291.

[12] AHMED N, BAHAR M, KENNISH L, et al. Assay of advanced glycation endproducts in selected beverages and food by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2005, 49(7): 691-699.

[13] 鄭文華, 許旭. 美拉德反應的研究進展[J]. 化學進展, 2005, 17(1): 122-129.

[14] 劉志強, 侯凡凡, 王力. ELISA法檢測人血清晚期糖基化終產物及在血液透析病人的應用[J]. 解放軍醫學雜志, 2000, 25(6): 391-393.

[15] PISCHETSRIEDERB M, MORALESC C, LECLEREA F, et al. Assessment of protein glycation markers in infant formulas[J]. Food Chemistry, 2004, 87(2): 253-259.

[16] 肖韋華, 買娜, 王旭峰, 等. 酶聯免疫吸附法在植物性食品安全檢測中的應用[J]. 食品科學, 2006, 27(12): 920-923.

[17] 王守法, 闞春月, 許學書. 酶聯免疫吸附試驗在食品檢測中的應用[J]. 食品科學, 2009, 30(23): 489-493.

[18] LIANG Jiehour. Kinetics of fluorescence formation in whole milk powders during oxidation[J]. Food Chemistry, 2000, 71(4): 459-463. [19] BOEKE M. Effect of heating on maillard reactions in milk[J]. Food Chemistry, 1998, 62(4): 403-414.

[20] ZAMORA R, HIDALGO F. Coordinate contribution of lipid oxidation and Maillard reaction to the nonenzymatic food browning[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2005, 45(1): 49-59.

Determination ELISA Coupled with Fluorescence Spectroscopy of Browning Products of Milk Powder during Accelerated Storage

LIU Ling1,2，YANG Shuang-hua1，JI Shu-juan1，Leif Horsfelt SKIBSTED2
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；2. Department of Food Science, Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen 2200, Denmark)

This study aimed to determine the browning products—advanced glycation end products (AGEs) in milk powder stored under accelerated conditions at 65 ℃ for 20 days by ELISA coupled with fluorescence spectroscopy. Results indicated that higher amounts of AGEs and fluorescent compounds were formed with prolonged storage time. ELISA could effectively determine the content of AGEs in milk powder when the concentration of both primary antibody and HRP-labeled secondary antibody was diluted to 2500 times. The highest content of AGEs in whole milk powder was observed, reaching 0.61 ng/mL, after 20 days of storage, and the minimum detected concentration was 0.006 g/mL. The maximum relative error was around 5% and good repeatability was found. Therefore, fluorescence intensity and the level of AGEs could be applied to evaluate the quality of milk powder.

milk powder；browning products；advanced glycation products；enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)；fluorescence analysis

TS201.2

A

1002-6630(2013)18-0249-04

10.7506/spkx1002-6630-201318051

2012-08-28

劉玲(1973—)，女，副教授，博士，研究方向為食品化學與分析。E-mail：liuling4568@sina.com