電針對局灶性腦缺血大鼠學習記憶能力的影響及其機制①

馮曉東，劉嬌，陳立典

·基礎研究·

電針對局灶性腦缺血大鼠學習記憶能力的影響及其機制①

馮曉東1，劉嬌2，陳立典1

目的 觀察電針神庭、百會對局灶性腦缺血大鼠學習記憶能力的影響，以及海馬組織病理學和核因子-κB p65 (NF-κB-p65)及其抑制蛋白(IκB)mRNA表達的改變。方法線栓法制備局灶性腦缺血損傷大鼠模型。45只Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組、模型組、電針組，每組15只。電針組行電針干預14 d。14 d后行跳臺測試；HE染色觀察大鼠海馬組織形態學；逆轉錄-PCR(RT-PCR)檢測大鼠海馬組織中NF-κB-p65和IκB mRNA水平。結果跳臺實驗顯示，電針組大鼠在3 min內受到電擊次數(2.2±0.94)次，較模型組的(7.60±2.67)次顯著減少(P＜0.001)，電針組跳下平臺的平均潛伏期(137.33±32.20)s，較模型組的(76.93± 28.57)s顯著延長(P＜0.001)。電針組大鼠海馬區域細胞損傷及NF-κB-p65 mRNA水平明顯降低、IκB mRNA水平明顯提高。結論抑制腦缺血海馬組織中神經細胞的溶解及NF-κB-p65的活化，可能是電針改善局灶性腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力的機制之一。

腦缺血；電針；學習記憶；核因子-κB；核因子-κB抑制蛋白

[本文著錄格式]馮曉東，劉嬌，陳立典.電針對局灶性腦缺血大鼠學習記憶能力的影響及其機制[J].中國康復理論與實踐, 2013,19(3):227-230.

認知功能障礙是腦缺血損傷后患者常見的功能障礙之一。認知障礙患者的計算、記憶等高級腦功能受損[1]，不僅直接影響患者日常生活能力和生活質量[2]，而且嚴重影響運動、感覺等其他功能康復。本課題組前期臨床實踐發現，電針督脈穴神庭、百會可改善腦缺血后患者的認知功能。近年來初步研究證實，大鼠腦組織缺血后，缺血區域核因子-κB p65(nuclear factor κB p65,NF-κB-p65)表達升高，NF-κB-p65抑制劑可明顯改善缺血大鼠學習記憶功能，提示NF-κB-p65在腦缺血后學習記憶功能的恢復中起重要作用[3]。本研究觀察電針神庭、百會對局灶性腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力、大鼠海馬組織病理形態學及NF-κB-p65及其抑制蛋白(IκB)mRNA水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

45只清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重(260±20)g，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供(許可證號：SYXK(閩)2005-004)。適應性喂養1周后，用隨機數字表法將大鼠編號，并分為假手術組(n= 15)、模型組(n=15)、電針組(n=15)。

1.2 主要實驗試劑及儀器

1.2.1 試劑 10%水合氯醛；蘇木精、伊紅：福建中醫藥大學醫學實驗中心提供；Trizol：Invitrogen；cDNA逆轉錄試劑盒及 PCR Master Mix：Fermentas；NF-κB-p65、IκB mRNA上下游引物：上海生工公司合成。

1.2.2 儀器 熒光定量PCR儀：BioRad,Model Gel Doc 2000,USA；DTT-2型大鼠跳臺儀：中國醫學科學院藥物研究所；YF-7FB型攤片烤片機：湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司。

1.3 動物模型制備

術前所有實驗動物禁食12 h。大鼠稱重后，以腹腔注射水合氯醛3 ml/kg麻醉。分離并暴露左側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈及其深部分支翼腭動脈。依次結扎頸總動脈近心端、頸外動脈遠心端，并于頸總動脈分叉處近心端預留結扎線。用微動脈夾夾閉翼腭動脈及遠端頸內動脈。距頸總動脈分叉處1.0 mm處用顯微剪刀剪一切口，將備好的線栓插入頸內動脈，插入長度約18.0～22.0 mm，至大腦前動脈近端，完全阻斷大腦中動脈血供。縛緊預先放置于頸總動脈的結扎線，頸部傷口常規縫合。2 h后，輕柔回抽線栓至頸總動脈分叉處。術中和術后保持室溫25℃左右，用白熾燈照射動物，使其肛溫維持在(37±1)℃，直到恢復活動。假手術組只分離動脈，不結扎、插線。手術結束后，動物置于室溫(25℃)環境下蘇醒，正常飲食。

1.4 干預措施

1.4.1 電針組 參考《實驗針灸學》取大鼠神庭和百會穴，應用GM101電針儀，電壓峰值6 V，以針體輕輕抖動為度，疏密波，頻率1～20 Hz。每次30 min，每天1次。手術后2 h開始治療，直至動物被處死。

1.4.2 模型組 造模后回籠飼養，只給予同等條件抓取，不給予任何治療。

1.4.3 假手術組 置于普通籠中飼養，只給予同等條件抓取，不給予任何治療。

1.5 跳臺實驗

在造模后第13天電針干預完畢后，將各組大鼠放入跳臺儀的反應箱中，箱底鋪直徑為1 mm銅柵，通36 V交流電；銅柵的一角固定一橡膠平臺作為安全區。將動物放在銅柵上，當動物四足同時接觸銅柵時，會受到2 s，0.5 mA電擊，使動物從銅柵跳到平臺上；當動物再次回到銅柵時將受到1次電擊。記錄3 min內大鼠受到電擊次數。動物受電擊后，放回飼養籠中；24 h后，再將動物放到平臺上，記錄動物移到銅柵的時間(潛伏期)。

1.6 取材及檢測

1.6.1 HE染色 麻醉下開胸，生理鹽水200 ml經左心室快速沖洗，4%多聚甲醛(pH=7.4)400 ml灌流固定。取腦后置入4%多聚甲醛內4℃固定24～48 h。定位腦缺血區，常規脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚5 μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，蘇木精和伊紅染色，光鏡下觀察組織病理學變化。

1.6.2 NF-κB-p65、IκB mRNA水平檢測 取左側海馬組織置于液氮罐中速凍，再置于-80℃冰箱保存。

取100 mg腦組織，研磨后加入Trizol 1 ml，震蕩30 s。加氯仿0.2 ml，劇烈搖動30 s，室溫靜置5 min。12000 g、4℃離心15 min。輕輕吸取上層無色水相，移入另一只EP管中(約0.5 ml)。加等體積異丙醇，室溫放置10 min。12000 g、4℃離心10 min。加入75%乙醇1 ml，振蕩。7500 g、4℃離心5 min。棄上清，小心吸取殘留乙醇，開蓋干燥5 min。用DEPC水20 μl溶解RNA，檢測RNA濃度，根據RNA濃度，計算RNA體積。

按照Fermentas公司提供的cDNA逆轉錄及PCR擴增試劑盒及說明書加入相應量的試劑。引物序列：NF-κB-p65：正義：5′-GTG CAG AAA GAA GAC ATT GAG TG-3′，反義：5′-AGG CTA GGG TCA GCG TAT GG-3′；IκB：正義：5′-AAG CGG TCG GAC AAT ACT TCA C-3′，反義：5′-TTG CCA AAA CAA TGG GTG TAA G-3′；β-actin：正義：5′-ACT GGC ATT GTG ATG GAC TC-3′，反義：5′-CAG CAC TGT GTT GGC ATA GA-3′。擴增體系20 μl,其中cDNA模板1 μl，上下游引物各0.4 μl，Mix 10 μl，加水8.2 μl。反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，NF-κB-p65 60℃、IκB 56℃、β-actin 58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環。取PCR產物5 μl，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色鑒定，凝膠成像。計算圖像軟件分析電泳條帶。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 跳臺實驗

電針組大鼠遭受電擊次數顯著少于模型組(P＜0.001)，電針組大鼠跳下平臺的平均潛伏期顯著延長(P＜0.001)。見表1。

2.2 HE染色

模型組大鼠海馬組織中神經細胞稀少、排列疏松；存在廣泛神經細胞溶解；細胞結構模糊、變形，少數神經細胞染色加深，組織間質疏松。電針組損傷較模型組細胞溶解較輕，排列致密，結構較完整。假手術組未見病理改變(圖1)。

2.3 PCR

模型組大鼠海馬組織中NF-κB-p65 mRNA擴增產物電泳條帶光密度較假手術組升高，IκB mRNA較假手術組降低。與模型組相比，電針組NF-κB-p65 mRNA擴增產物電泳條帶光密度降低，IκB mRNA升高(圖2)。見表2。

表1 各組大鼠跳臺實驗結果

表2 各組大鼠NF-κB-p65和IκB mRNA水平(相對值)

圖1 HE染色觀察電針對大鼠海馬組織病理形態學的影響

圖2 各組海馬組織NF-κB-p65和IκB mRNA

3 討論

神庭屬督脈，可寧神醒腦；百會位居巔頂，經氣沿走向過頭部，與大腦聯系密切。兩穴通常合用而起到開竅醒神，補腎養精，改善認知功能的作用[4-5]。

NF-κB在許多免疫和炎癥反應、凋亡的基因轉錄調節中起著重要作用[6]。正常情況下，在大腦皮層和海馬區域，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合，處于低水平狀態。腦缺血再灌注后，氧化應激的產生導致自由基和白細胞增多，當細胞受到細胞因子等信號刺激時，IκB在IκB激酶(IκB kinase,Iκk)的作用下發生磷酸化而降解，與NF-κB解離，游離NF-κB迅速由細胞質移位到細胞核，與多種基因的啟動子部位κB位點結合，轉錄調節多種細胞因子和炎癥介質、黏附分子、生長因子等，被認為是炎癥級聯反應的中心靶點。因此抑制NF-κB活性及其轉錄途徑現已成為藥物研發的熱門靶點[7]。

完整的神經網絡系統是學習和記憶功能的物質基礎，以海馬部位為代表的大腦邊緣系統既是腦缺血的敏感區域，也是學習記憶功能形成的關鍵部位[8]。大腦中動脈閉塞(MCAO)后，由于遠隔損害所造成的非梗死血管管轄區如海馬部位軸突退行性改變、神經營養因子缺乏、神經生長抑制因子的存在、局部腦血流的減少、神經遞質調節失衡及蛋白合成減少等原因[9]，導致其對應功能如學習、記憶能力受損。

本研究中，我們觀察到電針14 d可以明顯提高腦缺血再灌注損傷大鼠的被動學習和記憶能力，HE染色觀察到電針可以減少大鼠海馬組織中神經細胞溶解、壞死，從而從動物行為學、病理形態學上初步證實了電針神庭、百會對大鼠學習記憶能力的改善及其神經保護作用。

本研究還顯示，局灶性腦缺血再灌注損傷引起NF-κB-p65抑制蛋白IκB的磷酸化降解，從而活化了NF-κB-p65，而電針能降低NF-κB-p65的活化。提示電針神庭、百會改善腦缺血再灌注損傷大鼠學習和記憶能力可能與抑制NF-κB-p65的活化有關。

對電針神庭和百會干預腦缺血再灌注損傷大鼠進行認知行為學、組織病理學和分子生物學的研究有助于全面闡明電針治療腦缺血再灌注損傷后學習記憶障礙的作用機制。仍需深化研究，為臨床應用提供理論依據。

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[4]張愛君.五神針高壓氧并用治療血管性癡呆42例[J].實用中醫內科雜志,2008,22(5):101.

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Effect of Electroacupuncture on Learning and Memory Ability for Cerebral Ischemia/Reperfusion Injured Rats

FENG Xiao-dong, LIU Jiao,CHEN Li-dian.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,Fujian, China

ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)on learning and memory ability,as well as the finding of histopathology and the expression of mRNA of nuclear factor κB p65(NF-κB-p65)and its inhibitor(IκB)in the hippocampus of rats with cerebral ischemia/reperfusion(I/R)injury.Methods45 male Sprague-Dawley rats were were randomly diveded into sham control group(SC,n=15),ischemia control group(IC,n=15)and electroacupuncture group(EA,n=15).The latter 2 groups were modeled as focal cerebral I/R injury,and the EA group received electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)for 14 d.They were evaluated with the step down test,their hippocampus was observed under HE staining and the level of NF-κB-p65 and IκB mRNA was determined with RT-PCR 14 d after modeling.ResultsThe frequence of shock was less,and the latency jumping down from the safe platform was longer in the EA group than in the IC group(P＜0.001).The damage of the nerve cell and the expression of NF-κB-p65 mRNA significantly decreased and the expression of IκB mRNA increased in the EA group compared with those of IC group(P＜0.001).ConclusionThe inhibition of NF-kB-p65 might mediate the recovery of learning and memory impairment after electroacupuncture for cerebral ischemia.

cerebral ischemia;electroacupuncture;learning and memory;nuclear factor κB;inhibitor of nuclear factor κB

R743.3

A

1006-9771(2013)03-0227-04

2012-12-20

2013-01-30)

1.福建省科技廳重點項目(No.2010I0007)；2.科技部國際科技合作項目(No.2011DFG33240)。

1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建福州市350122；2.河南中醫學院，河南鄭州市450008。作者簡介：馮曉東(1968-)，男，河南鄭州市人，博士研究生，教授，主任醫師，碩士生導師，主要研究方向：腦病后功能障礙的康復和評定。通訊作者：陳立典(1962-)，男，福建政和市人，博士，教授，主任醫師，博士生導師，主要研究方向：中風后認知障礙、手功能障礙及痙攣肌的中西醫結合康復治療。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.03.007