粒細胞集落刺激因子結合行為訓練對缺血性腦損傷大鼠早期干預的研究①

張麗華，康貝貝，張偉，楊本利，李曉捷，王立蘋，張士嶺

粒細胞集落刺激因子結合行為訓練對缺血性腦損傷大鼠早期干預的研究①

張麗華1,2，康貝貝1，張偉1，楊本利1，李曉捷2，王立蘋2，張士嶺2

目的 探討粒細胞集落刺激因子(G-CSF)結合行為訓練對缺血性腦損傷大鼠的神經保護作用及對遠期學習記憶能力的影響。方法2月齡清潔級Wistar大鼠96只，分為假手術組(A組)、模型組(B組)，G-CSF干預組(C組)及G-CSF+行為訓練組(D組)。采用改良線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)2 h再灌注24 h模型(A組不插入線栓)。各組分別于造模成功后1周、2周、4周、8周隨機選取6只，利用穿梭實驗視頻分析系統計算逃避潛伏總時間，HE染色和免疫組織化學染色觀察造模后大鼠海馬區病理變化及神經生長因子(NGF)、G-CSF水平。結果造模后，B組NGF、G-CSF表達短暫升高，C、D組表達總體上高于B組，尤以D組為著(P＜0.05)；逃避潛伏總時間各組均延長，總體上B組長于C組，C組長于D組(P＜0.05)。隨著時間的延長，這一趨勢更加明顯。結論結合行為訓練較單一應用G-CSF神經保護作用更強，且顯著提高遠期學習記憶能力。

缺血性腦損傷；粒細胞集落刺激因子；行為訓練；早期干預

[本文著錄格式]張麗華，康貝貝，張偉，等.粒細胞集落刺激因子結合行為訓練對缺血性腦損傷大鼠早期干預的研究[J].中國康復理論與實踐,2013,19(3):231-234.

近年來大量研究發現，粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)對缺血性腦損傷大鼠具有近期神經保護作用，但對其長期保護作用并不清楚。舒細記等研究表明，行為訓練可增加樹突棘密度，擴大突觸聯系范圍，增強空間學習記憶能力[1]。本研究觀察G-CSF結合行為訓練對缺血性腦損傷大鼠學習記憶及神經生長因子(nerve growth factor,NGF)表達及遠期學習記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡健康Wista大鼠96只，清潔級，雌雄各半，體重(200±30)g，由大連醫科大學動物實驗中心提供，常規喂養。

1.2 模型制備與分組

改良的線栓法[2]制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。大鼠蘇醒后參照Longa評分，1～3分動物入選。造模成功動物隨機分為3組：B組為非干預組，C組為G-CSF干預組，D組為G-CSF+行為訓練組；另設假手術組(A組)，造模過程中不插入線栓，其余操作同其他各組；每組24只，分1周、2周、4周、8周4個時間點，每個時間點各6只。

1.3 干預方法

A、B組不給予任何干預，常規飼養。C、D組于造模成功當天皮下注射G-CSF 50 μg/kg，每天1次，連續5 d。D組同時結合Morris水迷宮行為訓練：采用Morris水迷宮，將大鼠從任意一點放入水池，2 min后將其撈出，休息10 min再訓練2 min，每天上午進行3次訓練，連續2周。

1.4 觀察指標

利用穿梭實驗視頻分析系統檢測，記錄其逃避潛伏總時間，逃避潛伏總時間越短說明大鼠主動回避反應越迅速，學習記憶能力越強。腦組織常規HE染色，光鏡下觀察大腦皮質、海馬、齒狀回顆粒下層等部位腦組織病理改變；NGF、G-CSF免疫組織化學試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)檢測海馬CA3區NGF和G-CSF表達。CH30光學顯微鏡及自動成像系統(日本OLYMPUS)及顯微圖像分析系統(日本尼康)觀測其灰度值變化，表達水平越高，染色越深，灰度值越小。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學處理。實驗所得數據采用(±s)表示，兩組間比較用t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 穿梭實驗

各時間點A組無明顯變化，B、C、D組潛伏總時間均明顯長于A組(P＜0.01)。造模后1周時，B、C、D組潛伏總時間無顯著性差異。2周、4周時，D、C兩組潛伏總時間較B組縮短，D組較C組縮短(P＜0.05)。8周時，D組潛伏總時間較B、C兩組明顯縮短(P＜0.01)，B、C組間無顯著性差異。見表1。

2.2 HE染色

假手術組海馬CA3區錐體細胞排列整齊，高倍鏡下可見錐體細胞核大而圓、核仁明顯。缺血再灌注各組海馬區錐體細胞體積縮小，核固縮深染，間質水腫明顯，可見大量壞死灶。D組神經細胞結構較完整，排列相對規則，間質水腫明顯減輕，壞死灶面積明顯縮小。

2.3 NGF的表達

造模1周，B、C、D組NGF表達水平均高于A組，C、D組間無顯著性差異，但都高于B組(P＜0.05)。2周、4周時，B組NGF表達降至基礎水平，C、D組NGF表達均高于B組，D組高于C組(P＜0.05)。造模后8周，D組NGF表達水平明顯高于B、C兩組(P＜0.01)。見表2、圖1。

2.4 G-CSF的表達

造模1周，B、C、D組G-CSF表達水平均高于A組，C、D組間無顯著性差異，但都高于B組(P＜0.05)。2周時，B組G-CSF表達降至基礎水平，C、D組G-CSF表達均高于B組，C、D組間無顯著性差異(P＞0.05)。造模后4周、8周，D組G-CSF表達水平高于B、C兩組(P＜0.05)；C組降至基礎水平，與B組無顯著性差異。見表3。

表1 各組大鼠各時間點逃避潛伏總時間(s)

表2 各時間點海馬CA3區NGF的灰度值變化

表3 各時間點海馬CA3區G-CSF的灰度值變化

圖1 海馬CA3區NGF表達(免疫組織化學染色，100×)

3 討論

腦血管病是目前神經系統的常見病和多發病，其中缺血性腦血管病在腦卒中的發生率高達80%，且無特效治療方法[3]。缺血性腦損傷后，不僅存在運動功能障礙，很多患者還遺留有學習記憶障礙[4]。

G-CSF是一種多肽鏈的細胞生長因子，能動員骨髓干細胞增殖，并向腦內遷移分化為神經元和神經膠質細胞[5-6]。Hasselblatt等用大鼠模型證實，G-CSF以化學激活方式刺激遷移至腦損傷組織的干細胞釋放某種營養因子，促進其在腦內分化為神經元和膠質細胞[7]。

NGF是一種神經細胞生長調節因子，它對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用，增加腦的可塑性，提高腦損傷大鼠學習記憶能力[8]。

本研究觀察G-CSF對缺血性腦損傷大鼠NGF表達的影響。結果顯示，在2、4周時，G-CSF干預組NGF表達均明顯高于非干預組，且學習記憶能力較非干預組也有提高。其作用機制可能是在腦損傷或缺血狀態下，G-CSF以化學激活方式動員骨髓干細胞進入外周血，選擇性遷移至腦缺血部位；G-CSF刺激神經干細胞釋放NGF，促進干細胞在腦內分化為神經元和膠質細胞，進而促進受損組織的重塑和功能重建，提高學習記憶能力。繼續觀察發現，8周時G-CSF干預組NGF表達降至基礎水平，學習記憶能力與非干預組無顯著性差異(P＞0.05)，表明G-CSF不能發揮長期保護作用，對遠期學習記憶能力的提高作用并不明顯。

學習記憶障礙是腦缺氧缺血損傷所致的神經系統后遺癥之一。海馬對缺血性損傷較敏感，而海馬又是學習記憶能力最重要的功能區，其損傷可以導致學習記憶等認知障礙。江山等研究顯示，行為訓練可以增加海馬梗死后大鼠齒狀回區NGF的表達，增強大鼠海馬梗死后腦組織的修復能力，促進神經功能的重建[9]。本實驗聯合應用G-CSF與行為訓練對腦缺血大鼠進行早期干預，結果顯示G-CSF+行為訓練組NGF表達及學習記憶能力均明顯高于單一使用G-CSF組；第8周時，G-CSF+行為訓練組NGF和G-CSF表達仍維持在較高水平，學習記憶能力接近假手術組。推測行為訓練能夠刺激腦內細胞分泌G-CSF，使腦內G-CSF長時間維持在較高水平，并促進NGF表達增加，發揮長期神經保護作用，提高遠期學習記憶能力。

綜上所述，G-CSF結合行為訓練較單一應用G-CSF不僅神經保護作用明顯增強，而且作用時間長，并能提高遠期學習記憶能力。

[1]舒細記,柳威,周紅艷,等.G-CSF干預對老齡慢性腦缺血大鼠模型認知改善與膠質細胞可塑性的影響[J].中國老年學雜志,2011,31(3):450-452.

[2]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989,20:84-91.

[3]杜家琇,婁季宇,白宏英,等.環孢素A對大鼠急性腦缺血再灌注損傷小膠質細胞的活化及iNOS表達的影響[J].中國實用神經疾病雜志,2010,13(24):8-10.

[4]陳浩,畢竹梅,崔寧,等.不同時間窗高壓氧對腦缺血-再灌注大鼠模型學習記憶功能的影響[J].中國老年學雜志,2007,27 (15):1447-1449.

[5]Schneider A,Kuhn HG,Schabitz WR.A role for G-CSF(granulocyte colony stimulating factor)in the central nervous system[J].Cell Cycle,2005,4:1753-1757.

[6]Schneider A,Kruger C,Steigleder T,et al.The hematopoietic factor G-CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis[J].J Clin Invest, 2005,115:2083-2098.

[7]Hasselblatt M,Jeibmann A,Riesmeier B,et al.Granulocyt-colony stimulating factor(G-CSF)and G-CSF receptor expression in human ischemic stroke[J].Acta Neuropathol,2007,113: 45-51.

[8]Burkhalter J,Fiumelli H,Allaman I,et al.Brain-derived neurotrophic factor stimulates energy metabolism in developing cortical neurons[J].J Neurosci,2003,23(23):212-220.

[9]江山,李玲,袁華,等.行為學訓練對大鼠海馬梗死后齒狀回區神經生長因子表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2006,12 (3):207-209.

Early Intervention of Granulocyte Colony Stimulating Factor Combined with Behavior Training for Ischemic Brain Injury in Rats

ZHANG Li-hua,KANG Bei-bei,ZHANG Wei,et al.Rehabilitation Center for Child Cerebral Palsy,Jiamusi 154002,Heilongjiang,China

ObjectiveTo investigate the neuroprotective effect of granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)combined with behavior training on the learning and memory abilities of cerebral ischemic injury in rats.Methods96 Wistar rats,2 months old,were divided as sham group(group A),model group(group B),G-CSF group(group C)and G-CSF+training group(group D).Modified middle cerebral artery occlusion(MCAO)was used to establish a ischemia 2 h/reperfusion 24 h model to all the rats,except sham group.6 rats were selected in each group 1,2,4 and 8 weeks after successfully modeled,respectively.The abilities of learning and memory were detected with the latency of shuttle test video analysis system.The pathology of the hippocampus and the expression of nerve growth factor(NGF)and G-CSF were observed with HE and immunohistochemistry staining,respectively.ResultsThe expression of NGF and G-CSF increased in group B transiently,and increased more and longer in the group C and D,especially in group D,as the time passed(P＜0.05).The latency of shuttle test increased in group B,C and D,and gently decreased as the time passed,and the decrease more to less were group D,C and B(P＜0.05).ConclusionThe neuroprotective effects of G-CSF combined with behavior training are strengthened and long term beneficial than G-CSF alone.

ischemic brain injury;granulocyte colony stimulating factor;behavior training;early intervention

R743.3

A

1006-9771(2013)03-0231-04

2012-09-28

2012-11-29)

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(No.12511537)。

1.黑龍江省小兒腦性癱瘓防治療育中心，黑龍江佳木斯市154002；2.佳木斯大學兒童神經康復實驗室，黑龍江佳木斯市154002。作者簡介：張麗華(1957-)，女，黑龍江五?？h人，主任醫師，主要研究方向：腦損傷的綜合康復治療。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.03.008